一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒及其应用，包括试剂A液：P16

A double staining kit for cervical cancer assisted classification diagnosis and its application

The invention discloses a double staining kit for cervical cancer assisted classification diagnosis and its application, including the reagent A liquid: P16

【技术实现步骤摘要】
一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒及其应用
本专利技术属于液基细胞学免疫细胞化学领域，具体涉及一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒及其应用。
技术介绍
宫颈癌是指发生在宫颈阴道部或移行带的鳞状上皮细胞及宫颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤，是妇科常见的恶性肿瘤，发病率居妇科肿瘤第二位。中国是宫颈癌的高发地区，且宫颈癌的发病还具有年轻化的趋势。宫颈癌的发生发展是一个漫长且渐变的过程，从癌前病变到发展为癌大约需要十年时间。由于宫颈易于观察和取材，只要癌变前发现和正确治疗就可以预防宫颈癌。及早发现和正确治疗癌前病变能够极大程度上降低宫颈癌的发病率和死亡率，目前宫颈癌的筛查主要有细胞学筛查和人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)检测，通过筛查极大降低了宫颈癌的发病率和死亡率。但目前的筛查存在有一定局限，细胞学筛查常见轻度细胞异常情况，但大部分能自行转好不会发展为宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia，CIN)；HPV感染大多也是一过性感染，能自行转为阴性；而且两种检测方法都存在一定假阳性和假阴性的比例，造成漏诊和过度诊断的情况。目前有专利申请文件CN201510085334.8中提出了，对宫颈上皮组织标本，通过免疫组化双染的方法来判断宫颈上皮是否发生瘤样病变。该方法是对宫颈鳞状上皮组织样本的两种标记物磷蛋白(stathmin)和微小染色体维持蛋白(mini-chromosomemaintenanceproteins，MCM2)，通过使用免疫酶底物显色法来判断是否发生高度瘤样病变(CINIII)。但是该方法中样本为宫颈活检取材，属于有创性检测，一方面对个体带来创伤，另一方面以目前宫颈癌筛查标准需对病人进行二次取样，增加取样难度；还有该方法的两种标志物在癌前病变中的诊断研究还比较有限，临床应用更加有限。中国专利技术专利CN201210567622.3提出以宫颈脱落细胞，通过免疫细胞化学的方法检测P16INK4a蛋白表达来判断是否有宫颈癌前病变，但通过P16INK4a蛋白除了在宫颈异常增生细胞中过表达，也同时在输卵管化生细胞、子宫内膜细胞和正常柱状细胞中过表达，最终结果诊断仍需要结合细胞形态学来判断，降低医生的工作量比较有限。目前，国内外市场上关于宫颈癌筛查的细胞学染色检测试剂盒产品并不多见，且多以单一抗体为主，仅有的检测试剂盒产品也更多的是参照免疫组化试剂盒产品。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒及其应用方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒，包括试剂A液：P16INK4a抗体与Ki-67抗体组合成的混合一抗；试剂B液：碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)标记的羊抗兔二抗与辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的羊抗鼠二抗组合成的混合二抗；试剂C液：过氧化氢溶液；试剂D液：二氨基联苯胺；试剂E液：使试剂D液显色的缓冲液；试剂F液：核固红(fastred)色原；试剂G液：使试剂F液显色的缓冲液。本专利技术的有益效果在于：本试剂盒主要运用于细胞学筛查诊断结果为意义不明的非典型鳞状细胞(atypicalsquamouscellofundeterminedsignificance，ASCUS)或低度鳞状上皮内病变(low-gradesquamousintraepitheliallesion，LSIL)的患者，或在高危型HPV检查结果为阳性时，则可用该试剂盒进行检测，结果为双色阳性才能判断为阳性，单色阳性或者双阴结果则为阴性，通过双染鉴定结果更准确可靠，可以大大的减少阴道镜转诊率，减轻医生和病人的负担。该双染试剂盒运用了混合的免疫标记物P16INK4a抗体和Ki-67抗体，对宫颈鳞状上皮病变检测，由于两种抗体的运用，提高了检测的灵敏度和特异性，增加了细胞学的信息量，免疫显色的强烈颜色对比结果也简化了阅片医生的工作量。本专利技术双染试剂盒针对宫颈鳞状上皮脱落细胞，检测两种不同抗原的表达情况，P16INK4a蛋白和Ki-67蛋白分别表达于宫颈癌前病变细胞不同部位，P16INK4a蛋白主要表达于胞核和胞浆，Ki-67蛋白位于胞核表达，且均随着病变程度加深而表达量增加，两种抗体的联合使用可以使癌前病变诊断更加明确。本专利技术还包括上述双染试剂盒应用，具体操作流程包括以下步骤：S10预处理：取样本进行制片和固定后，再进行抗原修复后，先用试剂C液进行封闭处理；S20双染：滴加试剂A液孵育30～60分钟，用PBST洗涤液漂洗后滴加试剂B液孵育10～30分钟，再次用PBST洗涤液漂洗；然后滴加二氨基联苯胺显色液反应3～5分钟，自来水冲洗后用PBST洗涤液漂洗；滴加AP-Red显色15-30分钟，自来水冲洗终止反应；其中，所述二氨基联苯胺显色液为试剂D液和试剂E液的混合溶液，所述AP-Red显色液为试剂F液和试剂G液的混合溶液；S30复染：苏木素染色液复染10～60秒、自来水冲洗5～10分钟后，磷酸缓冲液(phosphatebuffersaline，PBS或PBS缓冲液)中返蓝8～15分钟，水性封片剂封片；所述应用以非治疗为目的。本专利技术的有益效果在于：本专利技术样本可直接采用宫颈液基细胞学剩余样本，可跟细胞学联合检测取材，不需要另外取样，减轻病人的负担。利用免疫细胞化学标记物作为混合抗体，不仅使得操作流程简便，而且还使得检测结果更精确，观察结果客观性更强，可有效减轻阅片医生负担。附图说明图1为本专利技术实施例1～3双染试剂盒的检测原理图。附图标记说明：1、P16INK4A抗原；2、小鼠抗人P16INK4A抗体；3、羊抗小鼠抗体；4、HRP；5、Ki-67抗原；6、兔抗人Ki-67抗体；7、羊抗兔抗体；8、AP。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术最关键的构思在于：采用即用型单克隆一抗混合试剂(针对人P16INK4a蛋白的鼠单克隆抗体和针对人的Ki-67蛋白的兔单抗体)检测P16INK4a蛋白和Ki-67蛋白，经过细胞固定、抑制内源性过氧化物酶活性并与一抗孵育后，采用即用型辣根或氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗和碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔二抗检测系统，而后显色反应基于HRP介导的3,3’-二氨基联苯胺(DAB)和AP介导FastRed的转化，从而在P16INK4a抗原位点上产生棕色沉淀，在Ki-67抗原位点上产生红色沉淀。一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒，包括试剂A液：P16INK4a抗体与Ki-67抗体组合成的混合一抗；试剂B液：AP标记的羊抗兔二抗与HRP标记的羊抗鼠二抗组合成的混合二抗；试剂C液：过氧化氢溶液；试剂D液：二氨基联苯胺；试剂E液：使试剂D液显色的缓冲液；试剂F液：核固红(FastRed)色原；试剂G液：使试剂F液显色的缓冲液。P16INK4a蛋白是一种重要的抑癌基因，在多数肿瘤中扮演着抑癌基因的角色，由于它的基因突变、缺失或启动子区甲基化，造成P16INK4a基因表达下调，参与多种肿瘤的发生和发展。目前，已经有报道显示，P16INK4a基因表达异常和宫颈本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒，其特征在于：包括试剂A液：P16

【技术特征摘要】
1.一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒，其特征在于：包括试剂A液：P16INK4a抗体与Ki-67抗体组合成的混合一抗；试剂B液：AP标记的羊抗兔二抗与HRP标记的羊抗鼠二抗组合成的混合二抗；试剂C液：过氧化氢溶液；试剂D液：二氨基联苯胺；试剂E液：使试剂D液显色的缓冲液；试剂F液：核固红色原；试剂G液：使试剂F液显色的缓冲液。2.根据权利要求1所述的宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒，其特征在于：所述试剂C液为3～5％的过氧化氢溶液。3.根据权利要求1或2所述的双染试剂盒的应用，其特征在于：包括以下步骤：S10预处理：取样本进行制片和固定后，再进行抗原修复后，先用试剂C液进行封闭处理；S20双染：滴加试剂A液孵育30～60分钟，用PBST洗涤液漂洗后滴加试剂B液孵育10～30分钟，再次用PBST洗涤液漂洗；然后滴加二氨基联苯胺显色液反应3～5分钟，自来水冲洗后用PBST洗涤液漂洗；再滴加AP-Red显色15-30分钟，自来水冲洗终止反应；其中，所述二氨基联苯胺显色液为试剂D液和试剂E液的混合溶液，所述AP-Red显色液为试剂F液和试剂G液的混合溶液；S30复染：苏木素染色液复染10～60秒、自来水冲洗5～10分钟后，PBS缓冲液中返蓝8～15分钟，水性封片剂封片；所述应用以非治疗为目的。4.根据权利要求3所述的双染试剂盒的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴莹莹，肖淑英，黄慧玲，李印淑，何伟，
申请(专利权)人：亚能生物技术深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44