一种双酚A的检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种双酚A的检测方法及检测试剂盒，属于环境污染物快速检测领域。本发明专利技术以双酚A单抗以及双酚A核酸适体为分子识别元件实现双识别，从而提高检测特异性，降低检测交叉反应，进一步通过DNA支点介导的链置换反应，释放具有催化活性的G四聚体核酸序列，形成的G四聚体具有类似辣根过氧化物酶催化活性，可催化使无色底物变成蓝色，双酚A浓度与蓝色变化成正相关，从而可以判断检测体系中的双酚A浓度。本发明专利技术灵敏度高，特异性好，常见的其他干扰物对检测不产生影响。检测过程无需检测仪器，结果直接肉眼可见，具有操作简单，成本低廉，响应迅速等优点，可用于不同样品中双酚A含量的快速检测。

A detection method and detection kit for bisphenol A

The invention discloses a detection method and a detection kit for bisphenol A, which belongs to the field of rapid detection of environmental pollutants. The invention of bisphenol A and bisphenol A monoclonal antibody aptamer as molecular recognition elements to achieve double recognition, thus improving the detection specificity, reduce cross reaction, further through the chain replacement reaction mediated release of DNA fulcrum, the catalytic G four dimer nucleic acid sequences, four G dimer formation with similar horseradish peroxidase catalytic activity of enzyme, can catalyze the colorless substrate becomes blue, bisphenol A concentration was positively correlated with blue change, which can determine the concentration of bisphenol A in detection system. The invention has high sensitivity and specificity, and other common interfering substances have no effect on the detection. The detection process does not need to be detected, and the result is directly visible to the naked eye. It has the advantages of simple operation, low cost and fast response. It can be applied to the rapid detection of bisphenol A content in different samples.

【技术实现步骤摘要】
一种双酚A的检测方法及检测试剂盒
本专利技术属于环境污染物快速检测领域，具体涉及一种双酚A的检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
双酚A(BisphenolA，BPA)常被用来合成聚碳酸酯(PC)和环氧树脂等材料，是制造塑料(奶)瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料(奶粉)罐内侧涂层等的主要原料。BPA具有很强的致癌性，常导致内分泌失调，诱发性早熟，威胁着胎儿和儿童的健康。传统的BPA检测主要依赖质谱色谱技术，包括HPLC、GC、HPLC-MS/MS等，虽然这些技术具有较高的灵敏度，当往往需要繁琐的样品前处理以及昂贵的检测仪器，难以用于现场快速检测，因此，迫切需要研制一种能用于BPA快速检测新技术，尤其是能实现检测结果直接肉眼可见具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双酚A的检测方法及检测试剂盒，涉及抗体与核酸适体双识别，结合G四聚体，用于双酚A的可视化快速检测。本专利技术所采取的技术方案是：一种双酚A的检测试剂盒，包括缓冲液、氯高铁血红素、固定有双酚A单抗的磁珠、核酸DNA1和DNA茎环结构H1，其中：核酸DNA1包括a区域和b区域；a是双酚A的核酸适体序列；DNA茎环结构H1依次具有c区域、d区域和e区域；其中e区域是G四聚体序列，且e区域的部分核酸序列与d区域核酸序列互补配对形成茎环结构的茎部分，e区域的剩余核酸序列形成茎环结构的环部分，c区域的核酸序列凸出在茎环结构外侧；DNA1的b区域和H1的c区域和d区域的核酸序列互补配对。优选的，核酸DNA1中a区域的序列为：5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'(SEQIDNO：1)。优选的，DNA茎环结构H1中e区域的序列(G四聚体序列)包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。优选的，DNA茎环结构H1中e区域的序列为：5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'(SEQIDNO：2)。优选的，c区域的碱基数为5-8个，更优选为6个。优选的，核酸DNA1的序列为:5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-GTTGGGTCGAGT-3'(SEQIDNO：3)。优选的，DNA茎环结构H1的序列为：5'-ACTCGA-CCCAAC-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'(SEQIDNO：4)。优选的，双酚A单抗上修饰有一定基团，使双酚A单抗能结合固定在磁珠上；或可采用其他方法固定。优选的，缓冲液包括反应缓冲液和显色缓冲液。优选的，反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH7.4，含有100mMNaCl以及25mMKCl。优选的，显色缓冲液，包含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mMKCl，10L0.5％的TMB，20L30％的H2O2，pH为5.0。优选的，试剂盒还包括磁性部件，如磁铁。一种双酚A的检测方法，包括下列步骤：在反应缓冲液中加入固定有双酚A单抗的磁珠，以及待测样品充分反应；加入适量的DNA1，充分反应，磁珠分离后去除多余的DNA1；加入适量的H1，充分反应；加入氯高铁血红素，充分反应；取上述反应液，加入到显色缓冲液中，通过溶液的颜色变化来判断结果；其中固定有双酚A单抗的磁珠、核酸DNA1、茎环结构H1、反应缓冲液和显色缓冲液如上任一项所述。本专利技术技术的核心点在于：1、抗体与核酸适体双识别。即磁珠上修饰抗体可与双酚A识别，同时DNA1中的核酸适体也会与双酚A识别。2、双识别后，有DNA序列能够打开茎环结构核酸，释放封闭的G四聚体序列。也即，抗体识别和核酸适体识别相接合。在本专利技术中，只用仅抗体识别，无法完成后面的检测。如果只是用单抗单识别，一些结构类似物，像双酚B、双酚C会产生非特异结合，因为抗体能与这些结构类似物非特异结合。而双酚A的核酸适体具有更高的特异性，甚至能区分微小结构差异，不会与双酚B、双酚C等产生非特异性结合。3、以H1中的c部分为DNA支点介导的链置换反应。本专利技术的有益效果是：(1)采用双酚A单抗以及核适体进行双识别双酚A，大大提高了检测的特异性，有效地避免了交叉反应。(2)以核酸G四聚体为信号报告分子，检测结果直接肉眼可见，无需检测仪器。整个检测过程响应迅速，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。附图说明图1为为双酚A检测原理示意图；图2为不同浓度的双酚A的检测结果；图3为特异性实验结果。具体实施方式本专利技术的反应原理如下：一种双酚A的检测方法，包括以下步骤：(图1所示)(1)双酚A单抗固定在磁珠上，磁珠分离后去除多余的单抗，加入待检测物双酚A。(2)单抗捕获双酚A，加入核酸DNA1，DNA1包含两部分，分别是a和b，其中a是双酚A的核酸适体，b是后续启动序列；DNA1的a部分进一步与BPA结合，磁珠分离后去除多余的DNA1。(3)加入茎环结构的核酸H1，在H1中包含三部分，分别是c、d以及e；其中c可作为DNA置换反应的支点，d部分处于H1的茎部分，e部分是G四聚体序列。没有打开的H1中e处于封闭状态，没有催化活性。(4)以H1中的c部分为DNA链置换反应的支点，DNA1中的b部分与H1的c以及d部分互补，从而打开H1，使H1的e部分暴露出来。(5)加入氯高铁血红素(Hemin)后，e部分会形成具有催化活性的G四聚体结构。它们能催化氧化TMB-H2O2(四甲基联苯胺-双氧水)检测体系，产生蓝色的底物，结果肉眼可见，从而达到检测双酚A的目的。没有双酚A时，体系是无色的。下面通过具体实施例对本专利技术进一步阐述，但不限于此。实施例1一种双酚A的检测试剂盒，包括以下成分：(1)核酸DNA1、H1，序列如下：DNA1:5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA(a)-GTTGGGTCGAGT(b)-3'(SEQIDNO：3)；H1:5'-ACTCGA(c)-CCCAAC(d)-GGGTAGGGCGGGTTGGG(e)-3'(SEQIDNO：4)；(2)生物素修饰的双酚A单抗；(3)链霉亲和素修饰的磁珠溶液；(4)磁铁；(5)双酚A标准溶液；(6)20mMTris-HCl缓冲液，pH7.4，含有100mMNaCl以及25mMKCl；(7)氯高铁血红素溶液；(8)显色缓冲液，包含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mMKCl，10μL0.5％的TMB，20μL30％的H2O2，pH＝5.0。实施例2一种双酚A的检测方法，按照如下步骤进行：(1)2mg/mL生物素修饰的双酚A单抗用20mMTris-HCl缓冲液(pH7.4，含有100mMNaCl以及25mMKCl)充分溶解，加入到1.5mg/mL链霉亲和素修饰的磁珠溶液中，充分混匀，室温反应30分钟，磁珠分离后去除多余的抗体。(2)加入不同浓度的双酚A或待测溶液，充分混匀，室温反应40分钟。(3)加入200nM的DNA1，充分混匀，室温反应30分钟，磁珠分离后去除多余的DNA1。(4)加入300nM的H1，充分混匀，室温反应40分钟。(5)加入0.5M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双酚A的检测试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、氯高铁血红素、固定有双酚A单抗的磁珠、核酸DNA1和DNA茎环结构H1，其中：核酸DNA1包括a区域和b区域；a是双酚A的核酸适体序列；DNA茎环结构H1依次具有c区域、d区域和e区域；其中e区域是G四聚体序列，且e区域的部分核酸序列与d区域核酸序列互补配对形成茎环结构的茎部分，e区域的剩余核酸序列形成茎环结构的环部分，c区域的核酸序列凸出在茎环结构外侧；DNA1的b区域和H1的c区域和d区域的核酸序列互补配对。

【技术特征摘要】
1.一种双酚A的检测试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、氯高铁血红素、固定有双酚A单抗的磁珠、核酸DNA1和DNA茎环结构H1，其中：核酸DNA1包括a区域和b区域；a是双酚A的核酸适体序列；DNA茎环结构H1依次具有c区域、d区域和e区域；其中e区域是G四聚体序列，且e区域的部分核酸序列与d区域核酸序列互补配对形成茎环结构的茎部分，e区域的剩余核酸序列形成茎环结构的环部分，c区域的核酸序列凸出在茎环结构外侧；DNA1的b区域和H1的c区域和d区域的核酸序列互补配对。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：核酸DNA1中a区域的序列为：5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：DNA茎环结构H1中e区域的序列包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：DNA茎环结构H1中e区域的序列为：5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'。5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：c区域的碱基数为5-8个。6.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于：DNA1的序列为:5'-CC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊华，潘家峰，周丹华，陈曼佳，
申请(专利权)人：广东省生态环境技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44