胶原特异结合能力的EGFR抗体及在脊髓损伤修复中的应用制造技术

本申请公开了一种具有胶原特异结合能力的EGFR抗体及其在脊髓损伤修复中的应用。所述具有胶原特异结合能力的EGFR抗体包含胶原结合区域和与所述胶原结合区连接的西妥昔单抗的功能区域Fab段。本申请提供的CBD‑Fab抗体具有良好的促进神经干细胞向神经元分化的能力，并可以与胶原材料高效结合而形成功能化胶原材料，这种功能化胶原材料既能抑制瘢痕的形成，又能封闭神经再生抑制分子的抑制作用，且CBD‑Fab抗体能从胶原材料上缓慢释放，进而可以创造合适微环境以诱导内源神经干细胞向神经元分化，促使其进一步的成熟及功能化，最终提高生物行为功能的恢复。

EGFR antibody of collagen specific binding ability and its application in the repair of spinal cord injury

This application discloses a kind of EGFR antibody with collagen specific binding ability and its application in the repair of spinal cord injury. The EGFR antibody with a collagen specific binding capacity includes a collagen binding region and a functional area Fab segment of the cetuximab, connected with the collagen binding area. CBD Fab antibody is provided with good ability to promote the differentiation of neural stem cells into neurons, and can efficiently combine with the collagen material and the formation of functional collagen material, the functional material can inhibit scar formation of collagen, and can inhibit the closed nerve regeneration inhibitory molecules, CBD and Fab antibody from the slow release of collagen material, which can create a suitable microenvironment to induce endogenous neural stem cells to differentiate into neurons, promote the further maturation and functional recovery, and ultimately improve the biological behavior and function.

【技术实现步骤摘要】
胶原特异结合能力的EGFR抗体及在脊髓损伤修复中的应用
本申请具体涉及一种具有胶原特异结合能力的EGFR抗体，特别涉及一种胶原特异结合能力的EGFR抗体修饰形成的功能化胶原材料、其制备方法及在脊髓损伤修复中的应用。
技术介绍
由于不可逆的神经元丢失以及胶质瘢痕的沉积，脊髓损伤最终将导致永久性的神经机能障碍。脊髓神经干细胞向神经元的分化是补充损伤丢失神经元以及功能恢复的有效策略。然而，脊髓损伤微环境中存在的许多髓鞘相关的抑制分子限制了神经干细胞分化为神经元的能力。脊髓损伤后，一系列复杂的病理生理学过程发生，其中包括机髓鞘相关抑制分子的产生和胶质瘢痕的沉积等。研究表明，脊髓损伤后，炎症性和抑制性微环境的产生是造成神经元分化比率低下的主要原因，并最终导致了行为功能恢复的失败。因此，如何重建脊髓损伤后神经再生的微环境是保证有效神经发生乃至行为功能恢复的关键。损伤微环境中神经再生抑制分子与各自受体结合，能引发胞内钙离子浓度的提高，激活表皮生长因子受体(EGFR)，使EGFR磷酸化，导致神经不能再生。神经损伤后，EGFR的活化是导致神经不能再生的原因。去除神经再生抑制分子的抑制作用，可以通过封闭EGFR实现，使EGFR不能被活化，从而使神经再生抑制分子的信号通路被阻断。西妥昔是EGFR的中和抗体，可用来封闭EGFR，使其不能被激活。研究表明，西妥昔可以促进神经干细胞向神经元的分化，进而提高脊髓损伤的修复效果。但是简单注射的西妥昔单抗往往不能聚集于损伤部位，而是伴随着体液扩散流失，不仅不能在损伤部位发挥最大作用，如果扩散到正常组织还会引起副作用。
技术实现思路
本申请的主要目的在于提供一种具有胶原特异结合能力的EGFR抗体修饰的胶原材料及其在脊髓损伤修复中的应用，以克服现有技术中的不足。为实现前述专利技术目的，本申请采用的技术方案包括：本申请实施例提供了一种具有胶原特异结合能力的EGFR抗体(如下简称“CBD-Fab抗体”)，其包含胶原结合区域和与所述胶原结合区连接的西妥昔单抗的功能区域Fab段。进一步的，所述的具有胶原特异结合能力的EGFR抗体主要由胶原特异结合多肽CBD与西妥昔单抗的Fab功能区融合形成。本申请实施例还提供了用于编码所述具有胶原特异结合能力的EGFR抗体的基因。进一步的，所述的基因具有SEQIDNO:1(轻链区)和SEQIDNO:2(重链区)所示的核酸序列。本申请实施例还提供了一种含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。本申请实施例还提供了所述具有胶原特异结合能力的EGFR抗体于制备产品中的应用，所述产品至少具有抑制脊髓鞘相关抑制分子产生和胶质瘢痕沉积的功能。本申请实施例还提供了所述具有胶原特异结合能力的EGFR抗体于制备产品中的应用，所述产品至少具有促进神经干细胞向神经元分化的功能。本申请实施例还提供了所述具有胶原特异结合能力的EGFR抗体于制备产品中的应用，所述产品至少具有修复脊髓损伤的功能。本申请实施例还提供了一种功能化胶原材料，其包含：胶原材料；以及，修饰在所述胶原材料上的、所述具有胶原特异结合能力的EGFR抗体。进一步的，所述具有胶原特异结合能力的EGFR抗体的胶原结合区域与胶原材料结合。前述胶原材料可优选自有序胶原材料，例如细丝状的线性有序胶原材料，其良好的生物相容性可以支持细胞粘附生长，有序的结构可以定向引导神经丝的延伸，并且可以通过占据损伤横截组织的腾空而在一定程度上抑制瘢痕的沉积。本申请实施例还提供了所述的具有胶原特异结合能力的EGFR抗体或者所述的功能化胶原材料于制备用于引导神经再生的生物材料中的用途。较之现有技术，本申请提供的CBD-Fab抗体具有良好的促进神经干细胞向神经元分化的能力，且CBD-Fab抗体可以与胶原材料高效结合而形成功能化胶原材料，这种功能化胶原材料既能抑制瘢痕的形成，又能封闭神经再生抑制分子的抑制作用，并且CBD-Fab抗体能从胶原材料上缓慢释放，进而可以创造合适的微环境以诱导内源神经干细胞向神经元分化，并促使其进一步的成熟及功能化，最终促进了生物行为功能的恢复。附图说明图1a是本申请实施例中一种CBD-Fab抗体的重组结构示意图；图1b是本申请实施例中一种胶原材料的线性结构示意图；图1c是本申请实施例中一种CBD-Fab抗体和NAT-Fab抗体的胶原结合能力比较图；图1d是本申请实施例中一种CBD-Fab抗体和NAT-Fab抗体从胶原上缓慢释放能力的比较图；图2a是本申请实施例中以荧光显微镜检测CBD-Fab抗体和NAT-Fab抗体封闭神经再生抑制分子的抑制能力的比较图；图2b是本申请实施例中CBD-Fab抗体和NAT-Fab抗体封闭神经再生抑制分子的抑制能力的定量分析图；图3a是本申请实施例中NESTIN,TUj-1和NeuN免疫染色评价CBD-Fab抗体修饰的胶原材料对内源神经分化的影响图；图3b是本申请实施例中NESTIN免疫染色评价脊髓损伤区内神经细胞的定量分析图；图3c是本申请实施例中TUj-1免疫染色评价脊髓损伤区内早期神经元的定量分析图；图3d是本申请实施例中NeuN免疫染色评价脊髓损伤区内成熟神经元的定量分析图；图4a是本申请实施例中SYN免疫染色检测突触位点形成情况图；图4b是本申请实施例中SYN免疫染色检测突触位点形成情况的定量分析图；图4c是本申请实施例中透射电镜检测神经突髓鞘化情况图；图4d是本申请实施例中透射电镜检测神经突髓鞘化情况的定量分析图；图5a是本申请实施例中H&E组织染色评价CBD-Fab修饰的胶原材料对空腔形成的影响的检测图；图5b是本申请实施例中H&E组织染色评价CBD-Fab修饰的胶原材料对空腔形成的影响的定量分析图；图5c是本申请实施例中CSPG免疫染色评价CBD-Fab修饰的胶原材料对瘢痕形成的影响的检测图；图5d是本申请实施例中CSPG免疫染色评价CBD-Fab修饰的胶原材料对瘢痕形成的影响的定量分析图；图6a是本申请实施例中电生理学检测大鼠脊髓全横断损伤模型制备是否成功的检测图；图6b是本申请实施例中BBB行为学评分检测大鼠脊髓损伤后0至12周的下肢行为恢复情况图；图6c是本申请实施例中电生理学检测大鼠脊髓损伤后第12周的运动诱发电位恢复情况图；图6d是本申请实施例中BBB行为学评分检测大鼠脊髓损伤后第12周的下肢行为恢复情况图。具体实施方式鉴于现有技术中的不足，本申请专利技术经长期研究和大量实践，通过采用了由胶原结合区域(collagenbindingdomain，CBD)和西妥昔单抗的功能区域Fab段重组构建了具有胶原结合能力的EGFR抗体(CBD-Fab抗体)。此种CBD-Fab抗体能特异结合到胶原材料上，使胶原材料作为携带西妥昔单抗的载体，具备促进神经干细胞向神经元分化的能力。本申请的专利技术人还进行了大量试验，包括：将CBD-Fab生物结合到胶原材料上形成了具有特异胶原结合能力的EGFR抗体修饰的胶原材料，实验证明，它既能抑制瘢痕的形成，又能封闭神经再生抑制分子的抑制作用。另外，通过体外和体内试验证明，CBD-Fab抗体可以与胶原材料高效结合，并能从胶原材料上缓慢释放下来。又及，经CBD-Fab修饰的胶原材料可以创造一个合适的微环境以诱导内源神经干细胞向神经元分化，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有胶原特异结合能力的EGFR抗体，其特征在于包含胶原结合区域和与所述胶原结合区连接的西妥昔单抗的功能区域Fab段。

【技术特征摘要】
1.一种具有胶原特异结合能力的EGFR抗体，其特征在于包含胶原结合区域和与所述胶原结合区连接的西妥昔单抗的功能区域Fab段。2.根据权利要求1所述的具有胶原特异结合能力的EGFR抗体，其特征在于：它主要由胶原特异结合多肽CBD与西妥昔单抗的Fab功能区融合形成。3.用于编码权利要求1或2所述具有胶原特异结合能力的EGFR抗体的基因。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：它具有SEQIDNO:1及SEQIDNO:2所示的核酸序列。5.一种含有权利要求3或4所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。6.权利要求1或2所述具有胶原特异结合能力的EGFR抗体于制备产品中的应用，所述产品至少具有抑制髓鞘相关抑制分子产生和胶质瘢痕沉积...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴建武，范彩霞，赵燕南，李晓然，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32