识别癌症特异性IL13Rα2的CAR T细胞制造技术

提供结合到IL13Rα2的抗原决定基的特异性结合分子或其片段，所述抗原决定基是优先发现于癌细胞而非健康细胞的表面上的受体多肽。示范性的特异性结合分子是包含IL13Rα2结合分子的片段和提供第二功能的肽的双特异性结合分子，所述第二功能提供T细胞信号传导蛋白的信号传导域的信号传导功能、T细胞活化的肽调节物或标记系统的酶组分。还提供编码这类特异性结合分子(例如双特异性结合分子)的聚核苷酸、载体、宿主细胞、医药组合物，和预防、治0或改善与癌症疾病如实体肿瘤疾病(例如多形性成胶质细胞瘤)相关的症状的方法。

Identification of CAR T cells of cancer specific IL13R alpha 2

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】识别癌症特异性IL13Rα2的CART细胞相关申请的交叉引用本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2015年1月26日提交的美国临时专利申请第62/107,980号和2015年10月23日提交的美国临时专利申请第62/245,771号的优先权权益，所述申请的公开内容均以全文引用的方式并入本文中。以引用的方式并入以电子版提交的材料本申请含有呈计算机可读形式的序列表作为本公开的单独部分，所述序列表以全文引用的方式并入并且标识如下：文件名：49923A_Seqlisting.txt；176,301个字节，2016年1月22日生成。
本公开大体上涉及癌症生物学领域并且涉及分子抗体-受体技术。
技术介绍
癌症对人类和非人类动物的健康具有重大威胁，其降低生活品质并且在太多情况下导致死亡。就所需的来源和人力来说，置于国家、区域和地方保健组织上的治疗和预防各种形式癌症的负担相当重。脊椎动物(包括人类)必须对抗疾病的一种主要武器是功能免疫系统。简单考虑治疗或预防癌症的免疫疗法可以让人得出如下结论：由于免疫系统提防外来或非自身物质并且癌细胞起因于内部，即其是自身物质，因此努力后成功的希望极小。然而，在我们的理解中，癌症和免疫学的持续进展正在可见地改善。例如在小鼠中突变体抗原是肿瘤破坏的有力标靶，并且在患者中靶向这些突变的肿瘤-浸润淋巴细胞引起持久的肿瘤消退。然而，对于疫苗方法，非突变体抗原已经被许多科学家推测为是癌症特异性或“相对癌症特异性”并且安全的抗原。然而，过继转移的T细胞可以在数量级上比接种更有效并且更具破坏性。因此，在现在停止的临床试验中用T细胞靶向MAGE-A3、HER-2或CEA已引起死亡或产生严重毒性(8-11)。如在2002年显示，具有极高或极低表达水平的靶抗原的癌细胞仅在免疫应答诱导中不同，而在效应阶段不如此(15)。高亲和力白介素-13受体α2(IL13Rα2)由多形性成胶质细胞瘤(GBM)以及若干其它肿瘤类型以高频率选择性地表达。靶向这种肿瘤特异性受体的一种方法利用缀合到细胞毒性分子的同源配位体IL-13。然而，这种方法缺乏特异性，因为针对IL-13、IL13Rα1的较低亲和力受体由正常组织广泛地表达。大多数的人类癌症缺乏可预测地存在并且充当有效标靶以由T细胞根除的特异性抗原。每一癌细胞类型具有产生不同肿瘤特异性抗原的独特的突变集合。尽管技术取得了巨大进展，但仍难以鉴别有效独特的抗原并且分离适当TCR用于自体T细胞的转导而用于过继免疫疗法。使用抗体或T细胞的过继免疫疗法在临床上以及实验上是最有效的免疫疗法，至少当考虑临床相关癌症时如此(22)。然而，使用嵌合抗体受体(CAR)和双特异性T细胞啮合蛋白(BiTE)的过继免疫疗法的显著成功在很大程度上受限于特异于患者中的CD19/CD20根除B细胞恶性病和正常B细胞的那些者，即，造血癌症。因此，需要对大范围实体肿瘤鉴别共享但具肿瘤特异性的抗原，并且同时需要开发可以诊断、预防、治疗或改善这些癌症的症状的预防剂和治疗剂，以及用于诊断、预防和治疗各种癌症的方法。
技术实现思路
本文公开表达特异性地识别并且结合于α2白介素13受体(即，IL13Rα2)的嵌合抗原受体(即，CAR)的T细胞。IL13Rα2特异性CAR一般在本文中被称作47-CAR，当在T细胞中表达时其有效地靶向并且杀死IL13Rα2阳性靶细胞。也公开确立如下的证据：具有短间隔区或SSR的47-CAR(即，47-CAR.SSR)展现以抗原依赖性方式诱导IL2产生的更大能力。本文进一步公开47-CAR.SSRT细胞在体内具有有效的抗肿瘤活性的实验证据。本公开提供(i)特异性靶向人类肿瘤相关抗原IL13Rα2的单克隆抗体(即，克隆47抗体)的重链(SEQIDNO：7)和轻链(SEQIDNO：8)可变区的序列，和(ii)展现由重链和轻链cDNA编码的呈scFv抗体型式的蛋白质或与其它功能部分的融合体的功能性的数据。也确定重链和轻链恒定区的序列并且发现其与基因银行(Genbank)Acc.第DQ381544.1号中的相对应序列一致。确切地说，以SEQIDNO：104形式阐述克隆47抗体的CH1序列，以SEQIDNO：105形式阐述CH2并且以SEQIDNO：106形式阐述CH3；以SEQIDNO：107形式阐述克隆47抗体的轻链恒定区序列；并且以SEQIDNO：108形式阐述克隆47抗体的铰链区。重链和轻链可以按不同型式布置，如单链抗体、双功能抗体、双特异性抗体和三特异性抗体、具有治疗蛋白和其它部分的融合体、人类或人源化全抗体以及人类或人源化Fab片段和其它功能衍生物。单链抗体或由重链和轻链编码的蛋白质的其它布置，例如双特异性结合分子，可以经过表达并且缀合到治疗载体(例如病毒、细胞、纳米材料)用于将治疗剂特异性递送到IL13Rα2过表达肿瘤中或用于使肿瘤负荷成像。由肿瘤细胞而非正常细胞表达的蛋白质是用于选择性递送细胞毒性分子的有吸引力的分子。因此，针对白介素-13(IL-13)的高亲和力受体白介素-13受体α2(IL13Rα2)是一种有前景的候选物。IL13Rα2以高频率在称为多形性成胶质细胞瘤(GBM)的侵蚀性并不可治愈形式的原发性脑肿瘤(1-3)中表达，以及被其它实体肿瘤(4)表达。相反，除睪丸之外，正常组织表达极少到不表达IL13Rα2(6)。值得注意地，许多组织广泛表达对IL-13具有低亲和力的一不同受体IL13Rα1(7-9)，使其成为肿瘤特异性免疫治疗应用的选择性靶向的较差候选物。若干研究已在临床前动物模型和临床试验中所测试的患者中研究出与衍生自假单胞菌外毒素A的重组细胞毒素缀合的IL-13融合蛋白(IL-13PE)的治疗特性，所述假单胞菌外毒素A在体外诱导IL13Rα2表达神经胶质瘤细胞中的细胞凋亡(17-22)。然而，这类药剂缺乏与IL13Rα2的相互作用的高特异性，因为其替代性地结合于广泛表达的IL13Rα1。因此，预期开发针对IL13Rα2表达细胞的特异性可以与效应子(例如T细胞、毒素)组合的高度选择性抗体片段会产生治疗有益的结果。本公开通过提供特异于IL13Rα2的蛋白质结合伴侣而非模拟IL13自身来获得IL13Rα2的肿瘤特异性，其将产生展现结合于IL13Rα1和IL13Rα2两者的能力的分子。此外，本公开提供一种编码这些癌症特异性IL13Rα2结合伴侣中的一种的聚核苷酸，包括针对特异于这些IL13Rα2结合伴侣中的一种的抗原决定基的结合伴侣包含密码子优化编码区的聚核苷酸。明确涵盖融合蛋白或嵌合体，其包含呈连接到肽的可操作连接形式的如上文所定义的IL13Rα2结合伴侣，所述肽提供第二功能，如T细胞信号传导蛋白的信号传导域的信号传导功能，T细胞活化的肽调节物或标记系统的酶组分。示范性的T细胞信号传导蛋白包括4-1BB(CD137)、CD3ζ和融合蛋白，例如CD28-CD3ζ和4-1BBCD3ζ。4-1BB(CD137)和CD28是T细胞的共刺激分子；CD3ζ是T细胞抗原受体的信号转导组分。在某些实施例中，IL13Rα2特异性CAR可以按在不添加外源性物质情况下非活性的两个片段表达。借助于非限制性实例，CAR将由两个分子组成：1)第一分子将含有IL13Rα2特异性scF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种IL13Rα2特异性嵌合抗原受体(CAR)，包含：(A)以下的氨基酸序列中的每一个：NYLMN(SEQ ID NO：1)；RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQ ID NO：2)；GYGTAYGVDY(SEQ ID NO：3)；RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：4)；AASRQGSG(SEQ ID NO：5)；和QQSKEVPWT(SEQ ID NO：6)；(B)铰链区；(C)跨膜域；和(D)胞内域，所述胞内域包含信号传导域CD3ζ链和CD28的信号传导域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.26 US 62/107980;2015.10.23 US 62/2457711.一种IL13Rα2特异性嵌合抗原受体(CAR)，包含：(A)以下的氨基酸序列中的每一个：NYLMN(SEQIDNO：1)；RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQIDNO：2)；GYGTAYGVDY(SEQIDNO：3)；RASESVDNYGISFMN(SEQIDNO：4)；AASRQGSG(SEQIDNO：5)；和QQSKEVPWT(SEQIDNO：6)；(B)铰链区；(C)跨膜域；和(D)胞内域，所述胞内域包含信号传导域CD3ζ链和CD28的信号传导域。2.根据权利要求1所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述胞内域进一步包含以下中的一种或多种的信号传导域：CD137、CD134、CD27、CD40、ICOS和Myd88，任选地，其中所述胞内域包含SEQIDNO：68、70、72、74、76和78的氨基酸序列中的一个或多个。3.根据权利要求1或2所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述铰链区包含SEQIDNO：35或SEQIDNO：37的氨基酸序列。4.根据权利要求1到3中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含CD28的跨膜域。5.根据权利要求4所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQIDNO：39的氨基酸序列。6.根据权利要求1到5中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述CD3ζ链信号传导域包含SEQIDNO：41的氨基酸序列。7.根据权利要求1到6中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQIDNO：47的氨基酸序列。8.根据权利要求1到6中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQIDNO49或51的氨基酸序列。9.根据权利要求1到8中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQIDNO：7和/或SEQIDNO：8的氨基酸序列中的一个或两个。10.根据权利要求9所述的IL13Rα2特异性CAR，其中SEQIDNO：7的所述氨基酸序列经由连接子融合到SEQIDNO：8的所述氨基酸序列。11.根据权利要求10所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述连接子包含EEGEFSEAR(SEQIDNO10)的氨基酸序列。12.根据权利要求11所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQIDNO：13的氨基酸序列。13.根据权利要求1到12中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQIDNO：53或SEQIDNO：55的氨基酸序列。14.一种核酸，编码根据权利要求1到13中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR。15.根据权利要求14所述的核酸，包含SEQIDNO：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和65的序列。16.一种载体，包含根据权利要求14或15所述的核酸。17.根据权利要求16所述的载体，其是反转录病毒载体。18.一种宿主细胞，包含根据权利要求16或17所述的载体。19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其是人类宿主细胞。20.根据权利要求18或19所述的宿主细胞，其是T淋巴细胞。21.根据权利要求19所述的宿主细胞，其是自然杀伤细胞。22.根据权利要求18所述的宿主细胞，进一步包含IL15的可表达编码区。23.一种细胞群体，包含根据权利要求18到22中任一项所述的宿主细胞。24.根据权利要求23所述的细胞群体，包含至少107个宿主细胞。25.一种医药组合物，包含根据权利要求1到13中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR、根据权利要求14或15所述的核酸、根据权利要求16或17所述的载体、根据权利要求18到21中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求22或23所述的细胞群体，和药学上可接受的载剂。26.一种治疗个体的癌症的方法，包含以有效治疗所述个体的所述癌症的量向所述个体给予根据权利要求23或24所述的细胞群体。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述细胞群体的所述宿主细胞是获自所述个体的细胞。29.根据权利要求28所述的方法，其中获自所述个体的所述细胞是T淋巴细胞。30.根据权利要求28所述的方法，其中获自所述个体的所述细胞是自然杀伤细胞。31.根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞群体的所述宿主细胞表达IL15。32.一种IL13Rα2特异性嵌合抗原受体(CAR)，包含：(A)胞外域，所述胞外域包含以下的氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：IV巴利亚斯尼科瓦，MS列斯尼亚克，SMG戈特沙尔克，
申请(专利权)人：芝加哥大学，贝勒医学院，
类型：发明
国别省市：美国,US