本发明专利技术提供了新的单克隆抗体和使用所述新单克隆抗体的免疫测定、测定方法、试剂盒等，所述单克隆抗体对胶原片段的C端新表位具有特异性，在所述新表位含有的脯氨酸是非羟基化形式的情况下的结合亲和力与羟基化形式情况下的结合亲和力实质上相同。不受新表位中有无脯氨酸羟基化形式的影响，可以定量生物样品中由于胶原酶消化产生的胶原片段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及可以识别胶原新表位的单克隆抗体，基于所述抗体的免疫测定、基于所述抗体的测定方法、基于所述抗体的筛选方法、基于所述抗体的患者鉴别方法和基于所述抗体的试剂盒。
技术介绍
软骨降解是骨关节炎(OA)和慢性类风湿性关节炎(RA)等关节疾病的主要特征。 监控此类疾病中软骨丢失的进展情况为管理疾病(包括预后、诊断和处置)提供有效的信息。目前，通过X射线检测关节腔变小来监控软骨丢失。但是，X射线诊断不能同时满足检测的灵敏度和准确度。而且，X射线只显示过去发生过软骨丢失，而不显示现在的软骨降解情况。因此，监控各种关节疾病中的软骨破坏的进展情况的替代方法是非常有价值的。目前已知软骨中的胶原分解是通过被称为基质金属蛋白酶(MMP)的一组酶进行的。特别地，鉴于只有胶原酶(MMP-1、MMP_8和MMP-13)负责切断未变性的II型胶原的3重螺旋，认为胶原酶在975-976位的氨基酸残基之间的切断是之后由明胶酶等多种蛋白酶造成II型胶原从软骨基质脱离的关键事件。此外，此处的氨基酸残基参照GenBank数据库 C0L2A1 (登录号NP001835)的全长序列。降解后的胞外基质蛋白的片段从软骨释放到滑液中(SF)，之后通过血液在全身循环。因而，虽然血清或尿中的软骨基质蛋白质片段的水平通常低于SF中的水平，但如果可以对其检测，则能够更简便地评估OA和RA中的软骨降解。关于测定全身II型胶原片段存在2个主要问题。第一，关节软骨中的II型胶原的周转(turnover)通常非常低，因而血清或尿中的II型胶原片段的水平也非常低。即使 OA软骨中II型胶原的转换增加，所述增加也不是明显容易检测的非常大的变化。因而需要灵敏度非常高的测定。第二个问题是构成胶原的大部分脯氨酸和赖氨酸残基被羟基化修饰。特别地，由于脯氨酸是占胶原蛋白约3成的主要组成成分，在胶原酶切割位点附近也存在羟化脯氨酸，已知该羟化对结合亲和力具有很大影响。包含在胶原中的脯氨酸的羟基化是由脯氨酰4-羟化酶以依赖于铁离子和维生素 C的方式催化的，因此，羟基化程度易受胶原合成时的营养状态等的影响，不是恒定的。因而，期望的是用于测定II型胶原片段的抗体的结合亲和力不受脯氨酸有无羟基化的影响。迄今为止，已经专利技术了若干测定由胶原酶产生的II型胶原片段的系统，但无一具有足够的灵敏度、准确度。例如在Robin Poole等人的应用单克隆抗体C0L2-3/4C long(专利文献1)的竞争性ELISA方法中，对于胶原酶切割端结构的特异性低，且对于切割位点上游第5位(从N末端起第971位)的脯氨酸的非羟基化形式几乎没有反应性(非专利文献1)。 此外，对于使用Otterness等人的单克隆抗体9A4 (专利文献2)的夹心ELISA方法，对于胶原酶切割端结构的特异性高，但由于从切割端起上游第5个残基(从N末端起第971位)的脯氨酸的羟基化，结合亲和力降低至约1/90 (非专利文献2)。因此，对于大部分为羟基化形式的II型胶原片段的检测灵敏度低。由此可见，目前为止的任一种抗体都易于受胶原酶切割位点紧邻的脯氨酸羟基化修饰的影响，不能正确地测定羟基化形式和非羟基化形式混合存在的生物样品中的胶原片段的量。现有技术文献专利f献专利文献1 特许第四99416号专利文献2 特许第3258630号。非专利文献非专利文献 1 J Immunol Methods 294 (2004)第 145-153 页非专利文献 2 J Immunol Methods 247 (2001)第 25_；34 页。
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术要解决的课题是正确地测定生物样品中由胶原酶消化产生的胶原片段(胶原新表位)的量。用于解决课题的手段本专利技术人深入研究了针对胶原新表位的单克隆抗体的制备，结果制备出新的单克隆抗体，即使新表位的脯氨酸变为羟基化形式，所述抗体的结合能力也不变化，从而完成了本专利技术。换言之，本专利技术涉及(1)特异性结合胶原新表位片段的单克隆抗体，所述抗体结合序列号20所示氨基酸序列的962位至975位，其在包含于所述表位中的脯氨酸为非羟基化形式的情况下的结合亲和力与该脯氨酸为羟基化形式情况下的结合亲和力实质上相同；(2)上述(1)记载的单克隆抗体，其中上述(1)记载的脯氨酸是序列号20所示氨基酸序列中的971位的脯氨酸；(3)上述(1)记载的单克隆抗体，其中表位存在于序列号20所示氨基酸序列的957位至975位的区域中；(4)上述(2)记载的抗体，在使由序列号14、17或18所示氨基酸序列组成的肽竞争以便抑制所述抗体与由序列号2所示氨基酸序列组成的肽的免疫反应的免疫测定中，对任一种肽的所述免疫反应的50%抑制浓度在0. 04 μ M以下；(5)单克隆抗体，其具有1)互补决定区中含有以下氨基酸序列的重链可变区KYGIN(序列号5)、 WINTYSGMTTYADDFKG (序列号 6)和 SLGYDYGGFAY (序列号 7)，以及2)互补决定区中含有以下氨基酸序列的轻链可变区RSGQTLVHDNENTYFH(序列号8)、 KISNRFS (序列号 9)和 SQNTHVPFT (序列号 10)；(6)单克隆抗体，其具有1)具有序列号3的氨基酸序列的重链可变区；和2)具有序列号4的氨基酸序列的轻链可变区；(7)上述(1)-(6)的任一项记载的单克隆抗体，其是被标记的；(8)使用上述(1)- (6)的任一项记载的单克隆抗体的免疫测定；(9)使用上述(1)-(6)的任一项记载的单克隆抗体测定胶原新表位片段含量的方法；(10)测定胶原酶活性的方法，其以使用上述(1)-(6)的任一项记载的单克隆抗体测定的胶原新表位片段的含量为指标；(11)筛选胶原酶抑制剂的方法，其以使用上述(1)-(6)的任一项记载的单克隆抗体测定的胶原新表位片段的含量为指标；(12)鉴别胶原酶相关性疾病的患者的方法，包括使用上述(1)-(6)的任一项记载的单克隆抗体测定生物样品中含有的胶原新表位片段的含量的步骤；(13)包含上述(1)-(6)的任一项记载的单克隆抗体的试剂盒；(14)诊断胶原酶相关性疾病的方法，包括使用上述(1)-(6)的任一项记载的单克隆抗体测定生物样品中含有的胶原新表位片段的含量的步骤；和(15)上述(1)-(6)的任一项记载的单克隆抗体，其用于诊断胶原酶相关性疾病。专利技术的效果本专利技术的单克隆抗体可以特异性识别新表位末端结构，不受脯氨酸羟基化修饰的影响，因而可以正确地检测、定量生物体中的胶原新表位片段量。附图说明图1 显示了胶原酶切割位点，其在三聚螺旋结构的纤维状胶原(I型、II型和III 型)的示意图中的氨基末端起2/3的位置。下方显示了各种动物的II型胶原的胶原酶切割位点及其前后的氨基酸序列。从上至下是人、牛、狗、大鼠、小鼠的顺序。用星号显示了切割位点是975-976氨基酸残基之间，相当于人II型胶原的954-980位。图2 显示了利用具有20A10的各种C末端结构的肽片段的竞争性免疫测定的结^ ο图3 上部分的图显示了利用胶原酶消化和未消化的胶原对20A10的竞争性免疫测定的结果。下方的表显示胶原酶消化引起的特异性的改变以及I型、II型和III型胶原片段之间的交叉反应性。图4 显示了利用与II性胶原特异性单克隆抗体组本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：沼田义人，山内晃，小野田顺二，山根昌治，前田朋子，
申请(专利权)人：盐野义制药株式会社，
类型：发明
国别省市：
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