一种植酸酶分泌型转基因芽孢杆菌菌株ＮＫＴＳ，属于生物技术领域。植酸是土壤中磷的主要存在方式，但必须被植酸酶分解后才能被植物吸收利用。作为一种微生物肥料的硅酸盐细菌不分泌植酸酶，限制了它的应用。本发明专利技术将一个植酸酶分泌表达元件插入到转座子载体ｐＳＺ２１的ｍｉｎｉ－Ｔｎ５之内，构建成植酸酶分泌表达载体ｐＳＰ４３，首次通过基因枪的方法成功地将其转化到硅酸盐细菌内，构建了一个多功能的工程菌。弥补了野生芽孢杆菌不能分泌植酸酶、分解土壤有机磷的缺陷。转基因芽胞杆菌发酵液的增产效果最好，比对照增产２４．４％。与草炭混合的工程菌粉剂的增产效果次之，比对照增产１９．５％，节约磷肥效果达到３０％，节约钾肥效果达到２０％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因工程菌株，具体地说，是植酸酶分泌型转基因芽孢杆菌菌株。
技术介绍
磷是植物生长发育的必需营养元素之一，参与组成植物体内许多重要化合物，是植物体生长代谢过程不可缺少的。植物所利用的磷主要来源于土壤，土壤中磷的总含量约为0.02％～0.2％(P2O50.05％～0.46％)，与其它大量营养元素相比含量较低。据全国土壤普查资料估算，我国有2/3的土壤缺磷。缺磷的主要原因是由于土壤有效磷含量不足，施入土壤的大量磷素在土壤中以无效态被固定。磷肥的当季利用率一般只有10％～25％，不能满足一般作物的生理需求。植物吸收磷的主要形式是HPO42-和H2PO4-，由于土壤溶液中这种速效磷的浓度很低，一般只有1.5μmol/L，远不能满足植物正常生长所需，在许多土壤中磷是限制植物生长的一个主要因子。但是与氮素相比，作为磷肥原料的磷矿石资源地下埋藏量非常有限，且无法象合成氨一样人工合成。所以由于磷矿资源的短缺，磷可能成为二十一世纪全球农业持续发展的一个重要限制因子。植酸或者植酸盐是土壤中有机磷的主要形式，不同土壤中有机磷含量占土壤总含磷量的1/3～1/2，其中植酸盐的形式约占30％～50％；核酸态约占5％～10％；其它如磷脂、磷蛋白、磷酸糖各占1％～2％，还有相当一部分有机磷的形态目前仍不十分清楚(N.沃尔克，土壤微生物学，北京科学出版社，1981，75-87)。土壤有机磷通常能通过生物小循环不断补充，但是植酸盐类大多不溶于水，不能被植物利用，只有被植酸酶水解为无机磷之后才能为作物吸收利用。土壤中的无机磷极易被固定，因此磷是农作物生产中一个重要限制因子(Saxena S.N.Phytase activity of plant roots.J.Exp.Bot.，1964，15654-65)。植酸(phytic acid)也称肌醇六磷酸，其化学名称为环己六醇六磷酸酯，分子式为C6H18O23P6，它是一种淡黄色或淡褐色的粘稠液体，易溶于水、乙醇，几乎不溶于苯、氯仿、醚和己烷，比重1.59，分子量660.08。植酸本身毒性很小，但却具有很强的螯合能力，与EDTA接近。可与多种矿物质离子如镁、钾、钙、锰、铁、锌螯合，形成不溶性复合物。同时，还可与蛋白质形成螯合物；当介质pH值低于等电点时，生成植酸-蛋白质复合物，高于等电点时，形成植酸-金属离子-蛋白质复合物，因此具有抗营养作用。植酸的提取物为白色粉末，难溶于水。当植酸盐受到高热时可转化为五、四、三磷酸肌醇，其螯合能力依次下降，降至三磷酸肌醇时，对植物钙磷吸收的影响即很小(Han Y.W.Phytase production by AspergillusFicuum on semisolid substrate selectivity and kinetic characterization，Preparative Biochemistry，1988.184459-471)。植酸酶即肌醇六磷酸水解酶，它可以通过催化水解反应将磷酸盐从植酸中释放出来，因而利用植酸酶降解土壤中的植酸，不仅可以为植物提供可以吸收利用的无机磷，降低无机化肥的施用，防止无机化肥对土壤的破坏作用，又可以降低环境中的磷污染，防止土壤中的磷流失到水体中造成水体富营养化。植酸盐不仅螯合矿物质，而且螯合蛋白质等，运用植酸酶去除植酸的效果不仅对单个矿物元素有影响，而且对多种矿物元素具有一定作用。植酸降解，释放出矿物元素，有利于植物的生长。南开大学和日本北海道大学合作首次证明，番茄在缺磷条件下根系诱导分泌植酸酶，并证明植酸酶能够有效地水解土壤中的植酸态、核酸态和磷脂态土壤有机磷，释放出可被植物有效吸收的速效无机磷，但植物在正常条件下很少分泌植酸酶，在农业上难以应用(未发表材料)。2003年，本实验室李桂兰博士将无花果曲霉的植酸酶基因转化大豆植株，使得转基因植株根特异性表达植酸酶，分解土壤中的有机磷供植物吸收利用，成功的培育分泌植酸酶的磷高效利用型转基因大豆，这一研究证明了这一思路的可行性(李桂兰南开大学博士论文，2004)。二十世纪90年代后期，利用植酸酶开发解磷工程菌的研究也引起了植物营养学家的兴趣。随着生物技术的发展成熟和广泛应用，利用基因工程手段对野生工程菌的研究已经引起了植物营养学家和分子生物学家的关注，成为改善植物磷营养，缓解磷矿产资源危机，保证农业持续发展的研究热点。硅酸盐细菌是一类能分解硅酸盐矿物的细菌的俗称，经研究认为有释放铝硅酸盐矿物中钾素的能力，又称钾细菌，常见种为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)。该菌能分解长石、云母、土壤矿物等铝硅酸盐类的原生态矿物，使土壤中难溶性K、P、Si等转变为可溶性物质供植物生长利用，同时还可以产生多种生物活性物质促进植物生长。田间实验表明，以胶质芽孢杆菌为主要成分的生物钾肥在缺钾土壤中对各种农作物表现出较好的增产效果。因此，该菌作为一种生物钾肥在农业生产上被广泛应用(贺积强，李登煜，张小平等。硅酸盐细菌研究进展。西南农业学报，1999，12102～108)。针对上述情况，2001年，我们从土壤中筛选出一株具有较好的磷钾促溶、促进植物生长，并有抑制植物病原菌作用的野生型胶质芽孢杆菌D4B1菌株，该菌株的许多特性特别适合于开发微生物菌肥。但实验表明该菌没有明显的植酸酶活性，不能分解土壤中的植酸。我们采用微转座子技术将外源的植酸酶基因稳定地整合到胶质芽胞杆菌的基因组DNA上，构建组成型表达植酸酶的解磷解钾多功能工程菌，可用于开发工程菌肥，改善植物磷营养。硅酸盐细菌又称胶质芽孢杆菌，是一类特殊的土壤微生物，它能够产生大量的胞外多糖，并且能够分解土壤中的矿物质，释放出能够被植物直接吸收利用的可溶性钾、磷和硅，在农业和工业上有很大的应用价值。为提高其分解植酸态有机磷的能力，本专利技术将一个植酸酶分泌表达元件插入到转座子载体pSZ21的mini-Tn5内，构建成为植酸酶分泌型表达载体pSP43，首次通过基因枪的方法成功地将其转化到硅酸盐细菌内，构建了多功能的工程菌。通过Southern-blot分析，筛选到三个目的基因被稳定地整合到细菌染色体上的工程菌株。植酸酶活性分析表明，工程菌的植酸酶活性比出发菌提高了36-46倍。
技术实现思路
本专利技术填补了野生芽孢杆菌不能分泌植酸酶和分解土壤有机磷的缺陷，克隆了无花果曲酶的植酸酶基因，通过转基因技术将其稳定地整合到胶质芽孢杆菌的基因组DNA上，用于制备植酸酶分泌型多功能微生物菌肥，有效利用可通过生物小循环再生的土壤有机磷，缓解磷资源短缺，减少无机化肥的施用量，降低滥施无机磷化肥对土壤及环境的破坏作用。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的把植酸酶分泌表达载体pSP43转化到野生芽孢杆菌D4B1菌株中，构建成多功能工程菌，该菌株被命名为NKTS。本专利技术人保证从申请日起20年内向公众提供该工程菌。本专利技术是使用基因枪转化的方法将植酸酶分泌表达载体pSP43导入到胶质芽孢杆菌D4B1菌株中。(1)工程菌的构建方法1)质粒的构建以含有无花果曲霉植酸酶基因(phyA)的pMP2质粒为模板，PCR扩增不含有ATG起始密码子的phyA基因。引物序列如下上游引物5′-ATGCCCGGGCTGGC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植酸酶分泌型转基因芽孢杆菌菌株，其特征在于，该菌株命名为ＮＫＴＳ，它是使用基因枪转化的方法将植酸酶分泌表达载体导入到野生芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ）中构建成的多功能工程菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李明刚，李欣，张克勤，吴颖运，吴作为，李俊，李力，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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