本发明专利技术涉及一种高产L‑赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法。该方法将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF同时失活后构建获得，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提供一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株的构建方法，构建的菌株由于内源基因brnE和brnF的失活引起甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸胞外分泌量明显降低，与野生型相比，该菌株有利于生产高浓度的L‑赖氨酸，并能有效降低发酵液副产物的含量，作为L‑赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产和纯化成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法，属于生物技术
技术介绍
L-赖氨酸属于天冬氨酸族氨基酸，是人体八大必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。L-赖氨酸目前已被广泛用于动物饲料添加剂、食品加工、药物合成等方面。L-赖氨酸的生产方法主要包括:微生物发酵法(一步发酵法、两步发酵法)、酶法、蛋白水解法等。目前工业上生产L-赖氨酸最常用的方法是微生物发酵法，是借助微生物具有生物合成自身所必需氨基酸的能力，利用微生物的代谢作用，通过对菌株进行改造，选育出各种氨基酸营养缺陷型和氨基酸结构类似物抗性突变株，从而解除生物合成途径中的反馈阻遏和抑制作用，达到过量积累代谢途径中L-赖氨酸的目的。研究发现可用于L-赖氨酸生产的微生物主要为细菌，包括棒状杆菌、短杆菌、念球菌、假单胞菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等。目前，国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、黄色短杆菌(B.flavum)、乳酸发酵短杆菌(B.lactofermentus)和大肠杆菌(E.coli)菌株，但由于野生型菌株产L-赖氨酸能力差、副产物多，因此需要进行相应的改造，国内外对L-赖氨酸生产菌种的选育主要通过诱变育种技术和代谢工程育种技术。代谢工程育种是从分子水平上通过最小限度的、最明确的基因改造来优化选育菌株。然而，与野生型菌株相比较，这些菌株存在很大的缺陷，如生长速度缓慢，糖耗速率低，对外界不良环境耐受力差等。随着生物技术的发展及谷氨酸棒状杆菌基因组的解析，传统诱变育种获得L-赖氨酸高产菌方法逐渐被代谢工程育种方法所取代。同时大量研究表明，通过基因工程技术获得的基因工程菌，除保留了野生型菌株的一些优点外，还能很大程度上提高L-赖氨酸产量。如中国专利技术专利CN1539015公开了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在内的多个可用于赖氨酸产量提高的基因改进位点。中国专利文献CN101600796(申请号200780048626.8)、CN1974760(申请号200610163142.5)、CN103243042(申请号201310092638.8)分别对基因NCg22534、NCgl1835、NCg21090进行失活获得一系列L-赖氨酸产率提高的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法。本专利技术通过改造菌株谷氨酸棒状杆菌获得，具体策略为失活谷氨酸棒状杆菌BrnFE操纵子中brnE或brnF基因，或者对两基因同时进行失活，减少L-赖氨酸发酵时发酵液中副产
物氨基酸的含量，使更多的碳流量流向L-赖氨酸合成方向，提高L-赖氨酸发酵底物利用率，便于纯化。术语说明本专利技术中，“失活”可以通过本领域已知的任何失活方法来诱导。“失活”产生的效果是指内源基因brnE和brnF的表达分别或同时被降低到很低的水平，或者产生不表达基因以及尽管被表达但表达不具有活性或活性降低的产物。本专利技术中，“失活”可以通过基因工程手段在BrnFE操纵子中插入一个或多个碱基对，或者缺失该内源基因brnE和brnF中的一个或多个碱基对，或者由基因内部序列转换或颠换获得。本专利技术技术方案如下：一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，是将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF同时失活后构建获得，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。根据本专利技术优选的，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604。根据本专利技术优选的，上述高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，步骤如下：(1)在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF内各设计一条引物，通过PCR扩增内源基因brnE和brnF基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源臂序列，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)通过PCR扩增抗性标签基因片段；(3)将步骤(1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠PCR进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；(4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，即得。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组DNA为模板，PCR扩增同源臂序列NCg3，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F1:CGGGATCCTTGCCCGTTTCTATTCGGTT；R1:AAGGCCAGCAAAA TCTTCAGATCTATCGCATTGCT；PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿梭质粒pHT01(购自杭州宝赛生物科技有限公司)的DNA；PCR扩增抗性标签基因片段Cmr，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F2:GATCTGAAGA TTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：所述的PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的第一阶段扩增体系如下，总体系为25μl：重叠PCR的第一阶段扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2min，5个循环；72℃延伸10min；重叠PCR的第二阶段扩增体系为在第一阶段扩增后的产物基础上加入如下成分，总体系为50μl：重叠PCR的第二阶段扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)的具体步骤如下：(i)挑取谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)单菌落，在种子培养基中培养至菌体浓度OD600为0.7～0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得感受态细胞；(ii)对步骤(3)制得的融合基因进行单酶切，28～32℃酶切2～5h，高压电击转化至步骤(i)制得的感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在28～32℃培养0.5～2h后，筛选，即得。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(ii)中单酶切体系如下，总体系为40μl：根据本专利技术进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高产L‑赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF同时失活后构建获得，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF同时失活后构建获得，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604。3.权利要求1或2所述重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：(1)在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF内各设计一条引物，通过PCR扩增内源基因brnE和brnF基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源臂序列，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)通过PCR扩增抗性标签基因片段；(3)将步骤(1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠PCR进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；(4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，即得。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组DNA为模板，PCR扩增同源臂序列NCg3，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F1:CGGGATCC TTGCCCGTTTCTATTCGGTT；R1:AAGGCCAGCAAAA TCTTCAGATCTATCGCATTGCT；PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿
\t梭质粒pHT01的DNA；PCR扩增抗性标签基因片段Cmr，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F2:GATCTGAAGA TTTTGCTGGCCTTTTG...
【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞明，汪俊卿，李桂华，王蕾，王腾飞，王建彬，隋松森，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，诸城东晓生物科技有限公司，山东省饲料质量检验所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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