本发明专利技术公开了一株产氨基甲酸乙酯水解酶的赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus?fusiformis）SC02，于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?NO:M2012414，该梭形赖氨酸芽孢杆菌SC02能够在高渗环境（NaCl浓度大于15%）下快速降解氨基甲酸乙酯，对发酵食品中氨基甲酸乙酯的消除起到了积极的作用，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种梭形赖氨酸芽孢杆菌及其应用，特别是一种能合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶的梭形赖氨酸芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate, EC)，在医学上有重要用途，曾一度被用作治疗多发性骨髓瘤及慢性骨髓性白血病，以及作为麻醉剂使用。近年研究发现，氨基甲酸乙酯是一种人类潜在致癌物质，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，国际癌症研究机构在2007年把氨基甲酸乙酯列为2A类致癌物。氨基甲酸乙酯是一种伴随发酵食品(如酒精饮料、豆酱、酱油等)的生产过程中产生的副产物，对食品安全和生物体健康都有着严重的影响和危害。面对氨基甲酸乙酯所造成的食品安全问题，以微生物及酶降解实现食品中氨基甲酸乙酯的无危害化，是较理想的解决方案。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一株产氨基甲酸乙酯水解酶的梭形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis) SC02,已于2012年10月19日保藏于中国典形微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC N0:M2012414。菌落呈蜡样不透明，边缘不规则，菌落直径2-4_，培养1-2天菌落为白色，3天后菌落颜色逐渐加深，最终显暗棕色。好氧或兼性厌氧。菌体革兰氏阳性，无荚膜，1000X显微镜下观察细胞呈杆状梭形，部分菌体顶端生有椭圆形芽孢。所述梭形赖氨酸芽孢杆菌分离自成年雌性小`鼠肠道，其保藏条件如下:从生长良好的平板上挑取单菌落转接入营养肉汤培养基中，在30°C，200rpm，培养16h，取500 μ L培养液移入含有500 μ L40%甘油的保藏管中，置于_80°C冰箱保存。上述的营养肉汤培养基为二形营养肉汤培养基，配方为蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,氯化钠5g，蒸馏水1L，如需固体培养基，再添加2%琼脂。本专利技术的另一个目的是提供上述梭形赖氨酸芽孢杆菌的应用，其合成的耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶可以在NaCl浓度大于15%的条件下的条件下快速分解发酵食品中的副产物氨基甲酸乙酯并产生乙醇和氨气。其在最适PH8.0时具有最高酶活40U/g，在NaCl浓度大于15%的条件下，梭形赖氨酸芽孢杆菌所产生的耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶能够保持20%的酶活。本专利技术提供的梭形赖氨酸芽孢杆菌能合成耐高渗氨基甲酸乙酯水解酶，在pH为8.0时具有最高酶活，能在高渗条件下快速分解氨基甲酸乙酯。在pH为8.0的条件下，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活为40U/g，在NaCl浓度大于15%的条件下，其能保持20%的氨基甲酸乙酯水解酶酶活。说明书附1梭形赖氨酸芽孢杆菌显微照片图2pH对梭形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影响图3梭形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶对NaCl的耐受性具体实施例方式实施例1:梭形赖氨酸芽孢杆菌筛选方法将25g每只5周大雌性昆明小鼠进行五天的强饲氨基甲酸乙酯溶液(200mg/kgbody weight/day)后解剖，并用浓度为0.9%的生理盐水冲洗小鼠肠道组织,取组织悬浮液ImL于1000 Xg下离心10分钟，取上清液接种于富集培养基中(牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaC15g，氨基甲酸乙酯IOgjjC lOOOmL，pH7.0)，30°C下通气培养20h。培养液于2000Xg离心5min,取上清涂布于筛选培养基(牛肉浸膏IOg,蛋白胨10g,NaC15g,氨基甲酸乙酯30g,琼脂20g，水lOOOmL，pH5.0)中培养三天。挑选菌落形态较大的菌株转移到营养肉汤培养基中培养20h后进行保藏。挑取_80°C保藏的菌株在营养肉汤琼脂固体培养基上划线，于37°C培养24h后，挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，37°C在转速为200rpm的摇床培养24h，离心5min (12000rpm, 4°C )后收集菌体，再用ρΗ7.0的磷酸盐缓冲液重悬浮菌体至0.lg/mL。通过超声破碎进行酶粗提液的提取，对粗酶液进行氨基甲酸乙酯水解酶酶活测定检测到一株具有氨基甲酸乙酯水解酶活性的菌株，通过16S rDNA序列分析可知该菌株为一株梭形赖氨酸芽孢杆菌，已于2012年10月19日保藏于中国典形微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC N0:M2012414，保藏地址为中国武汉武汉大学。实施例2:氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的提取方法挑取_80°C保藏的菌株在营养肉汤琼脂固体培养基上划线,于37°C培养24h后,挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，37°C在转速为200rpm的摇床培养24h，收集菌液50mL于冷冻高速离心 机中低温离心IOmin (10000rpm,4°C )后收集菌体，菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS或50mM Tris_HCl(缓冲液pH应根据所筛选的蛋白稳定范围选取)重悬洗涤三次。再用PH7.0的磷酸盐缓冲液悬浮菌体至0.lg/mL。将菌液在_80°C冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。将反复冻融的菌液，置于冰水浴中进行超声破碎(可适当添加少量溶菌酶加快破碎速度)，超声条件:25W，工作2S，间隔2S，重复工作30min，直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间60min。将菌体超声破碎后于低温离心机中离心IOmin (lOOOOrpm，4°C )，将上清液转移到干净的Eppendorf管中，低温保存。实施例3:氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的酶活检测方法氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液酶活检测方法的原理是利用在一定条件下，氨基甲酸乙酯降解酶科将氨基甲酸乙酯分解生成乙醇，氨气和二氧化碳。氨与苯酚-次氯酸钠反应形成靛酚蓝显蓝色，用分光光度计在630nm处测其吸光值，分析氨的生成量，从而得到氨基甲酸乙酯水解酶的酶活。酶活测定试剂的配制:显色剂1:称取15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL显色剂I1:称取13.125g氢氧化钠和7.5mL次氯酸钠用超纯水定容至250mL终止剂:称取IOg三氯乙酸用超纯水定容至IOOmLNH4+标准溶液制备:lmL氨水溶于超纯水中并定容至145mL,配成0.lmol/L的NH4+溶液，并以此为母液，用超纯水将之稀释并配制成0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L 的 NH4+ 标准溶液。氨离子标准曲线的绘制:分别精确移取ImL NH4+标准梯度液置于顺序编号的IOmL比色管中。37°C下恒温保温15min，立即吸取ImL终止剂于比色管中，振荡混匀。再依次加入ImL显色剂I和显色剂II，强烈振荡，使之充分混匀，反应20min。超纯水定容至10mL，在630nm下比色测定OD值，以OD值为纵坐标，NH4+梯度为横坐标作图，得到标准曲线。酶活的测定取两支IOmL比色管,分别加入ImL酶液和超纯水。然后在两管中分别加入ImL超纯水，在37°C恒温水浴箱中反应15min后，在两管各加入ImL三氯乙酸终止剂，混匀后加入ImL的显色剂I和ImL显色剂II，强烈震荡，继续在37°C恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL,630nm处比色,并记录OD值。酶活计算公式:酶活力=Δ OD630 XnXkX 10/15式中:Λ OD630:酶反应后样品测定与本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产氨基甲酸乙酯水解酶的梭形赖氨酸芽孢杆菌SC02(Lysinibacillus?fusiformis?SC02)，于2012年10月19日保藏于中国典形培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?No：M2012414。
【技术特征摘要】
1.一株产氨基甲酸乙酯水解酶的梭形赖氨酸芽孢杆菌SC02 (Lysinibacillusfusiformis SC02)，于2012年10月19日保藏于中国典形培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2012414。2.权利要求1所述的梭形赖氨酸芽孢杆菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，方芳，张继冉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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