本发明专利技术涉及一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法。该方法将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl1221基因失活后构建获得，NCgl1221基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提供一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株的构建方法，构建的该菌株由于内源基因NCgl1221失活引起谷氨酸胞外分泌量明显降低，与野生型相比，该菌株可生产高浓度的L‑赖氨酸，并能有效降低发酵液副产物谷氨酸的含量，作为L‑赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产和纯化成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法，属于生物技术
技术介绍
L-赖氨酸属于天冬氨酸家族氨基酸，是人和动物体八大必须氨基酸之一。L-赖氨酸具有多种生理功能，如具备平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因而被广泛应用于饲料、食品及医药行业中。由于市场需求旺盛，L-赖氨酸目前已成为仅次于谷氨酸的第二大氨基酸品种，年产量约350万吨。工业上生产L-赖氨酸的方法主要有三种，即蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法由于具有低成本、高产率、低污染等优势成为目前L-赖氨酸生产的主流方法。目前可用于L-赖氨酸生产的微生物主要为细菌，包括棒状杆菌、短杆菌、念球菌、假单胞菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等，其中以属于棒状杆菌属的谷氨酸棒状杆菌目前应用最为广泛。虽然自然界微生物能够直接发酵产生L-赖氨酸，但产量通常较低，因此需要对微生物进行改造。如中国专利技术专利CN1539015公开了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在内的多个可用于赖氨酸产量提高的基因改进位点。中国专利文献CN101600796(申请号200780048626.8)、CN1974760(申请号200610163142.5)、CN103243042(申请号201310092638.8)分别对基因NCg22534、NCgl1835、NCg21090进行失活获得一系列L-赖氨酸产率提高的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法。本专利技术通过改造菌株谷氨酸棒状杆菌获得，具体策略为失活谷氨酸棒状杆菌内源基因NCgl1221(编码谷氨酸胞外转运蛋白)以降低赖氨酸发酵过程中谷氨酸的胞外分泌，减少L-赖氨酸发酵时发酵液中副产物谷氨酸的含量，使更多的碳流量流向L-赖氨酸合成方向，提高L-赖氨酸发酵底物利用率，便于纯化。术语说明本专利技术中，“失活”可以通过本领域已知的任何失活方法来诱导。“失活”产生的效果是指内源基因NCgl1221的表达被降低到很低的水平，或者产生不表达基因以及尽管被表达但表达不具有活性或活性降低的产物。本专利技术中，“失活”可以通过基因工程手段在内源基因NCgl1221中插入一个或多个碱基对，或者缺失该内源基因NCgl1221中的一个或多个碱基对，或者由基因内部序列转换或颠换获得。本专利技术技术方案如下：一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，是将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl1221基因失活后构建获得，NCgl1221基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。根据本专利技术优选的，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604。根据本专利技术优选的，上述构建方法，步骤如下：(1)通过PCR扩增NCg l1221基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源臂序列，NCgl1221基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)通过PCR扩增抗性标签基因片段；(3)将步骤(1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠PCR进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；(4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，即得。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组DNA为模板，获得同源臂NCg1，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F1:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT；R1:AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿梭质粒pHT01(购自杭州宝赛生物科技有限公司)的DNA，获得氯霉素抗性基因Cmr；PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：所述的PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的第一阶段扩增体系如下，总体系为25μl：重叠PCR的第一阶段扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，5个循环；72℃延伸10min；重叠PCR的第二阶段扩增体系为在第一阶段扩增后的产物基础上加入如下成分，总体系为50μl：重叠PCR的第二阶段扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)的具体步骤如下：(i)挑取谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)单菌落，在种子培养基中培养至菌体浓度OD600为0.7～0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得感受态细胞；(ii)对步骤(3)制得的融合基因进行单酶切，28～32℃酶切2～5h，高压电击转化至步骤(i)制得的感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在28～32℃培养3～4h后，筛选，即得。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(ii)中单酶切体系如下，总体系为40μl：根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(i)中，种子培养基，每升组分如下：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96g。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(i)中，电转缓冲液，每升组分如下：山梨醇85～96g、甘露醇85～96g、甘油95～105mL。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(i)中，高压电击转化的条件为：2100V电击5ms。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(ii)中液体复苏培养基，每升组分如下：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96g、甘露醇65～73g。上述构建方法制得的高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌在生产L-赖氨酸中的应用。构建原理谷氨酸胞外转运蛋白，负责谷氨酸的胞外分泌，但在高产L-赖氨酸菌种中，专利技术人通过研究发现该基因的表达则会造成L-赖氨酸发酵时发酵液中副产物谷氨酸的含量的增加，导致碳流量流向L-赖氨酸合成方向减少，进而影响包括赖氨酸的合成在内的细胞其它代谢过程。因此，通过构建NCgl1221基因失活，从而达到获得L-赖氨酸高本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，其特征在于，将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl1221基因失活后构建获得，NCgl1221基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，其特征在于，将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl1221基因失活后构建获得，NCgl1221基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604。3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤如下：(1)通过PCR扩增NCg l1221基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源臂序列，NCgl1221基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)通过PCR扩增抗性标签基因片段；(3)将步骤(1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠PCR进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；(4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，即得。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组DNA为模板，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F1:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT；R1:AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿梭质粒pHT01的DNA；PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl...
【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞明，汪俊卿，王蕾，王腾飞，李桂华，王建彬，隋松森，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，诸城东晓生物科技有限公司，山东省饲料质量检验所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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