本发明专利技术公开了一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。采用酶工程技术、分子生物学技术结合代谢工程理论和发酵工程技术等高新生物技术，利用底物结构类似物抗性突变株和苯丙氨酸、酪氨酸双营养缺陷型的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，分别依据代谢工程理论，进行解除谷氨酸棒杆菌自身反馈调节、增强代谢流、增强色氨酸生物合成途径中关键酶的催化活性、增加底物生物合成量的研究，合理设计并改造谷氨酸棒杆菌的色氨酸生物代谢途径，得到产酸率和转化率符合合同要求的以玉米为原料生产饲料级L-色氨酸的基因工程菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。
技术介绍
DAHP合成酶是代谢流向芳香族氨基酸的第一个关键酶，编码基因为AroI，它催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和四磷酸赤藓糖(E4P)合成3-脱氧-D-阿拉伯-7磷酸庚酮糖(DAHP)，进而生成分支酸，分支酸在色氨酸操纵子和其他酶的共同参与下最终转化为色氨酸，并分泌到胞外。随着分子生物学技术的飞速发展，在蛋白质定向进化技术和基因克隆表达方法相结合的基础上，使得催化活性提高的DAHP合成酶突变基因等位替换到基因组或在工程菌中过量表达成为可能，使代谢流向有利于色氨酸合成的方向，从而提高色氨酸产量。近年来，人们 对大肠杆菌的DAHP合成酶研究较为深入，在NCBI结构数据库中已收录了该酶的晶体结构，David L等人对Hisl80、Craig M等人对Cys61、Cys328分别做了定点突变，但催化活性都没有得到提高，国内复旦大学胡昌云等人确定了 AroGL175Q、AroGL175A、AroGL175D、Phe209Ser突变体酶催化活性分别提高1.33倍、1.57倍、1.65倍、1.8倍，而对工业上生产氨基酸的主要菌种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的研究鲜见报道，唯有Liao H-F等人报道Ser 187对该酶的变构效应起到重要的作用。大肠杆菌的DAHP合成酶AroG基因150-189位与谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶Aro I基因158-197氨基酸高度保守，推断谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶L183Q突变体对该酶的催化活性也会有所提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供了一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。为解决上述技术问题，本专利技术通过以下方案来实现:谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法，所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332，大肠杆菌 DH5 α ；所述谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下:I)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于IOml LB液体培养基中，30°C摇床培养12h，次日2%接种量接入IOOml LB液体培养基；2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENE BANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID:1018979)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物:上游引物Pl:5’ -TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCA CTCGAAA-3’；下游引物 P2:5’ -TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3’，其中下滑线部分为Nde I和Xho I酶切位点；3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增:以Pl，P2为引物，反应条件采用热启动PCR方式:95°C预变性4min，80°C pause 加入 Primer starHS 酶，之后 94°C 30s, 60°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s,58°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s,56°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s,54°C 40s,72°C 120s2 个循环；94°C 30s, 52°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s, 50°C 40s, 72°C 120s20个循环后；72°C延伸20min补加0.5 μ I Ex Taq酶加A尾，反应结束后取5 μ I扩增产物用I%的琼脂糖凝胶电泳检测；4)、PCR产物的回收，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于_20°C，目的片段与克隆载体的连接，将回收的PCR产物连接到pMD18-T-Simple载体上，连接反应中各种反应组分及加样量重量比分:回收的PCR产物4.5，pMD18-T-simple载体0.5，SolutionI5,总体积10，在16°C连接过夜，用CaCl2法制备DH5 α感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞；5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选；6)、重组质粒的鉴定，采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定；7)、重组质粒的核苷酸序列测定，对经上述步骤6)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养，制备成甘油菌，进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-simple-aroI ；所述L183Q定点突变，该突变过程如下:I)、合成酶突变位点的选择，合成酶的定点引物的设计，根据所要突变的位点设计两条反向互补中间突变引物，Ml:5’ -TCAGGTGCACCGCCAGCAGGCTTCTGGGATGTCTA-3’ ；M2:5 ’ -TAGACATCCCAGAAGCCTGCTGGCGGTGCACCTGA-3 ’，其中下滑线为突变位点；2)、PCR扩增DAHP突变基因，以测序正确的重组质粒pMD 18T_s imp Ie-Aro I为模板，以突变引物高保真循环PCR扩增，按下表体系扩增:权利要求1.谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法，其特征在于:所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332及大肠杆菌DH5 α ； 所述谷氨酸棒杆菌合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下: . 1)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于IOmlLB液体培养基中，30°C摇床培养12h，次日2%接种量接入100ml LB液体培养基； .2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENEBANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID:1018979)及pET_28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物:上游引物Pl:5’ -TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCACTCGAAA-3 ’;下游引物 P2:5 ’ -TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3 ’，其中下滑线部分为 NdeI和Xho I酶切位点； . 3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增:以Pl，P2为引物，反应条件采用热启动PCR方式:95°C预变性4min，80°C pause加入 Primer starHS 酶，之后 94°C 30s, 60°C 40s, 72°C120s2 个循环；94°C 30s, 58°C 40s,72°C 120s2 个循环；94°C 30s, 56°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s,54°C 40s, 72°C 120s2个循环；94°C 30s, 52°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C30s, 50°C 40s, 72°C 120s20 个循环后；72°C延伸20min补加.0.5 μ I Ex Taq酶加A尾，反应结束后取5 μ I扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电本文档来自技高网...
【技术保护点】
谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法，其特征在于：所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG?332及大肠杆菌DH5α；所述谷氨酸棒杆菌合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下：1)、谷氨酸棒杆菌LG?332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG?332单菌落接种于10m1?LB液体培养基中，30℃摇床培养12h，次日2％接种量接入100ml?LB液体培养基；2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENE?BANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032?DAHP合成酶基因(aro?I)核苷酸序列(GeneID：1018979)及pET?28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物：上游引物P1：5’?TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCA?CTCGAAA?3’；下游引物P2：5’?TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC?3’，其中下滑线部分为Nde?I和Xho?I酶切位点；3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增：以P1，P2为引物，反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primer?starHS酶，之后94℃30s，60℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，58℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，56℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，54℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，52℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，50℃40s，72℃120s20个循环后；72℃延伸20min补加0.5μl?Ex?Taq酶加A尾，反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；4)、PCR产物的回收，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于?20℃，目的片段与克隆载体的连接，将回收的PCR产物连接到pMD18?T?simple载体上，连接反应中各种反应组分及加样量重量比分：回收的 PCR产物4.5，pMD18?T?simple载体0.5，SolutionI5，总体积10，在16℃连接过夜，用CaCl2法制备DH5α感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞；5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选；6)、重组质粒的鉴定，采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定；7)、重组质粒的核苷酸序列测定，对经上述步骤6)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养，制备成甘油菌，进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为pMD18?T?simple?aroI；所述L183Q定点突变，该突变过程如下：1)、合成酶突变位点的选择，合成酶的定点引物的设计，根据所要突变的位点设计两条反向互补中间突变引物，M1：5’?TCAGGTGCACCGCCAGCAGGCTTCTGGGATGTCTA?3’；M2：5’?TAGACATCCCAGAAGCCTGCTGGCGGTGCACCTGA?3’，其中下滑线为突变位点；2)、PCR扩增DAHP突变基因，以测序正确的重组质粒pMD18T?simple?Aro?I为模板，以突变引物高保真循环PCR扩增，按下表体系扩增：反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primer?star?HS酶，之后94℃30s，55℃1min，68℃8min35个循环后；72℃延伸20min。反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；3)、Dpn?I酶消化原始模板，PCR产物直接按下表体系加入Dpn?I酶37℃消化4h，完成原始模板消化过程；4)、转化，将带缺刻的消化产物直接转化E.coli?DH5α；5)、阳性克隆筛选，氨苄抗性(100mg/L)、蓝白斑筛选阳性克隆；6)、重组质粒的鉴定，测序比对，测序结果与Aro?I序列比对确定目的突变正确性，测序正确的重组质粒命名为pMD18T?simple?Aro?I*。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘俊梅，胡耀辉，李琢伟，王丹，王玉华，朴春红，于寒松，代伟长，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：
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