本发明专利技术涉及一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，属于基因克隆技术领域。本发明专利技术方法首先配制一种通用缓冲液，Taq?DNA聚合酶和T4噬菌体DNA连接酶在该缓冲液中都具有酶活性。将待连接的DNA双链分子加入通用缓冲液中，用Taq?DNA聚合酶对DNA做加A处理后，再直接加入T4噬菌体DNA连接酶和线性载体，得到连接产物，进行转化后完成克隆反应。本发明专利技术方法省略了Taq?DNA聚合酶和T4噬菌体DNA连接酶反应之间DNA分子核酸的纯化步骤，极大提高了实验效率。
Method for quickly cloning gene using universal buffer
The invention relates to a method for rapidly cloning genes by using a universal buffer, which belongs to the technical field of gene cloning. The method of the present invention is to prepare a universal buffer, Taq DNA polymerase and T4 phage DNA ligase have enzyme activity in the buffer. Taq will be connected to the DNA double stranded molecule is added to general buffer, DNA and A do? Polymerase processing of DNA, and then directly into the bacteriophage T4 DNA ligase and linear vector, get connected product transformation after the completion of cloning reaction. The method of the invention omits the purification steps of the DNA molecular nucleic acid between the Taq DNA polymerase and the T4 phage DNA ligase reaction, which greatly improves the experimental efficiency.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于基因克隆领域。
技术介绍
遗传工程涉及大量将DNA片段在不同的物种或细胞间转移的操作，其中一个基本的步骤，就是将得到的DNA片段——无论它们是经过PCR扩增还是别的手段产生——插入到克隆载体中形成重组质粒。该重组质粒能够在细胞或者微生物的体内增殖，使得该DNA片段能长期保存，扩增，以便于后续研究。1991年，Holton.T.A和Graham M.W.等专利技术了“T-A”克隆方法。其原理是，用taqDNA聚合酶扩增的DNA，其3端都有突出一个腺嘌呤脱氧核苷酸(简称A);因此，研究人员研制出一种3端有突出一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸(简称T)的线性载体。载体和PCR产物的末端形成一对互补碱基，经T4DNA连接酶作用，两个线性DNA分子形成一个闭合的环状分子。这种闭合的环状分子成功转化感受态的大肠杆菌后，就能得到稳定的重组质粒。这种预制的线性载体被称简称为T载体。T载体的使用大大提高了 DNA的连接效率，长期以来得到广泛的使用，但是也有几个明显的缺点:第一，连接时间长。为了在转化后得到更多的克隆数和更高的阳性率，通常T载体和插入片段需要用T4DNA连接酶在室温连接12-16个小时。这一步花费了很长的实验时间。第二，只有taq DNA聚合酶扩增的DNA片段带有悬挂的A，而对高保真DNA聚合酶的扩增产物，是不含悬挂A的平端PCR产物。这类DNA分子需要用taq酶处理，使其3端加上一个腺嘌呤脱氧核苷酸，才能和T载体连接(通常简称为加A反应)。因此，在用T4噬菌体DNA连接酶作用之前，平端PCR产物要经过加A反应和`核酸纯化两个步骤。这两步操作耗时长达3 — 5个小时，同时也损耗了一部分DNA，极大地降低了克隆效率。上述的加A反应和连接反应，必须经过两步处理，是因为加A反应使用的taq DNA聚合酶，反应缓冲液最佳pH在8.3 — 9.0之间，连接反应使用的T4噬菌体DNA聚合酶，反应缓冲液最佳pH在7.5 — 8.0之间。这两种酶在对方的工作缓冲液都没有活性。因此，针对上述缺点，我们产生了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出，使用一种通用缓冲液，将双链DNA片段快速连接到克隆载体上，省略已有的两个酶反应之间DNA分子的核酸的纯化步骤，以提高实验效率。本专利技术提出的使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，包括以下步骤:( I)制备一种通用缓冲液，该通用缓冲液中各组分的摩尔浓度为:三羟甲基氨基甲烷(Tris)，浓度为250 — 500毫摩尔/升，氯化镁(MgC12)，浓度为10 - 20毫摩尔/升，二硫苏糖醇(DTT)，浓度为10 - 20毫摩尔/升，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(ATP)，浓度为5 —10毫摩尔/升，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)，浓度为100 - 200微摩尔/升，氯化六氨合高钴(Hexamminecobalt(III) Chloride),浓度为 50—100 微摩尔 / 升，用盐酸将通用缓冲液的pH值调至8.0 ；(2)用高保真DNA聚合酶 (如pfu DNA polymerase)通过聚合酶链式反应(PCR)得到双链DNA片段溶液；(3)取2微升步骤(I)的通用缓冲液，加入5微升步骤(2)得到的双链DNA溶液，再加入I微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在68 — 74°C下作用5 —10分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)的粘端DNA分子溶液；(4)在步骤(3)的反应体系中加入I微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体(T载体)和I微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应5 — 30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；(5)取5微升步骤(4)得到的连接产物，置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42°C热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200 — 500微升细菌液体培养基，在37°C摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200 — 400微升菌液涂布于含有I晕克异丙基β —D一硫代半乳糖昔(IPTG)和0.8晕克5_漠_4_氣-3- Π引噪-6-D-半乳糖苷(Xgal)的固体培养基平板上，在37°C温箱培养12 — 16小时，在平板上克隆出白色和蓝色的大肠杆菌细菌菌落。本专利技术提出的使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，其优点是:(I)本专利技术方法中配制和使用的通用缓冲液，其中含有Taq DNA聚合酶和T4噬菌体DNA连接酶，这两种酶在本溶液中都单独具有活性。因此，如果一个DNA双链分子要经过两个酶处理，这两个酶可以先后加入同一个缓冲液中，不需要在两步酶处理反应之间对DNA做纯化处理，这样不仅节省了近1-3个小时的操作时间，而且也减少了 DNA在纯化过程中的损耗。(2)传统的T4噬菌体DNA连接酶缓冲液反应时间比较长，需要的实验条件从几个小时到几十个小时不等，而聚乙二醇，六氨合高钴等添加剂加入到T4噬菌体DNA连接酶的工作缓冲液中，能极大的缩短反应时间。将这类添加剂加入到通用缓冲液中，更进一步缩短了克隆连接的时间。(3)使用本专利技术方法得到的连接产物，进行转化后的分析表明，无论转化子的数目，蓝白斑的比例，白斑的阳性率，都能达到传统的克隆反应的结果，极大提高了实验效率。具体实施例方式本专利技术提出的使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，包括以下步骤:( I)制备一种通用缓冲液，该通用缓冲液中各组分的摩尔浓度为:三羟甲基氨基甲烷(Tris)，浓度为250 — 500毫摩尔/升，氯化镁(MgC12)，浓度为10 - 20毫摩尔/升，二硫苏糖醇(DTT)，浓度为10 - 20毫摩尔/升，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(ATP)，浓度为5 —10毫摩尔/升，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)，浓度为100 - 200微摩尔/升，氯化六氨合高钴(Hexamminecobalt(III) Chloride),浓度为 50—100 微摩尔 / 升，用盐酸将通用缓冲液的pH值调至8.0 ；(2)用高保真DNA聚合酶(如pfu DNA polymerase)通过聚合酶链式反应(PCR)得到双链DNA片段溶液；(3)取2微升步骤(I)的通用缓冲液，加入5微升步骤(2)得到的双链DNA溶液，再加入I微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在68 — 74°C下作用5 —10分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)的粘端DNA分子溶液；(4)在步骤(3)的反应体系中加入I微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体(T载体)和I微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应5 — 30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；(5)取5微升步骤(4)得到的连接产物，置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42°C热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200 — 500微升细菌液体培养基，在37°C摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200 — 400微升菌液涂布于含有I晕克异丙基β —D一硫代半乳糖昔(IPTG)和0.8晕克5_漠_4_氣-3- Π引噪-6-D-半乳糖苷(Xgal本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤（1）制备一种通用缓冲液，该通用缓冲液中各组分的摩尔浓度为：三羟甲基氨基甲烷（Tris），浓度为250－500毫摩尔/升，氯化镁（MgCl2），浓度为10－20毫摩尔/升，二硫苏糖醇（DTT），浓度为10－20毫摩尔/升，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（ATP），浓度为5—10毫摩尔/升，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP），浓度为100－200微摩尔/升，氯化六氨合高钴（Hexamminecobalt(III)Chloride），浓度为50—100微摩尔/升，用盐酸将通用缓冲液的pH值调至8.0；（2）用高保真DNA聚合酶（如pfu?DNA?polymerase）通过聚合酶链式反应（PCR）得到双链DNA片段溶液；（3）取2微升步骤（1）的通用缓冲液，加入5微升步骤（2）得到的双链DNA溶液，再加入1微升体积浓度为3单位/微升的Taq?DNA聚合酶，在68－74℃下作用5—10分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）的粘端DNA分子溶液；（4）在步骤（3）的反应体系中加入1微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体（T载体）和1微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应5－30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；（5）取5微升步骤（4）得到的连接产物，置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42℃热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200－500微升细菌液体培养基，在37℃摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200－400微升菌液涂布于含有1毫克异丙基β—D—硫代半乳糖苷（IPTG）和0.8毫克5?溴?4?氯?3?吲哚?6?D?半乳糖苷（Xgal）的固体培养基平板上，在37℃温箱培养12－16小时，在平板上克隆出白色和蓝色的大肠杆菌细菌菌落。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴劲松，俞萍，李晓晨，孙克非，
申请(专利权)人：天根生化科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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