一种连接酶复合稳定剂及其在制备试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种连接酶复合稳定剂及其在制备克隆试剂盒中的应用。本发明专利技术提供一种连接酶复合稳定剂预混液，其含有连接酶复合稳定剂、连接缓冲液、增强剂和连接酶，所有组分都在一个反应体系中，采用一管式预混液，通过特殊稳定剂的加入，提高了片段和载体的连接效率，可在5

【技术实现步骤摘要】
一种连接酶复合稳定剂及其在制备试剂盒中的应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种连接酶复合稳定剂及其在制备克隆试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]在基因克隆领域，T4 DNA连接酶以ATP作为辅助因子，可以催化片段和载体间5
’‑
P末端和3
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OH末端形成磷酸二酯键，转化到大肠杆菌后实现把片段克隆到相应的载体上，从而进行基因序列的测序验证、保存或者蛋白表达纯化等，在分子生物学上有广泛的应用。
[0003]比较经典的连接方法是在连接体系中分别加入连接酶的缓冲液和T4 DNA连接酶，加样操作麻烦，连接效率不高。如果把连接酶的缓冲液和T4 DNA连接酶一起保存，又存在酶活不稳定的问题。
[0004]因此，亟需开发出一款高效、简便的一管式T4 DNA连接酶复合稳定剂预混液。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提供一种一管式T4 DNA连接酶复合稳定剂预混液及其在克隆试剂盒中的应用，该预混液可以进行片段和载体的高效连接，5
‑
10min即可完成反应，操作简便。
[0006]为此，本专利技术第一方面提供连接酶复合稳定剂。根据本专利技术的一些实施方案，所述连接酶复合稳定剂包括：
[0007]明胶、海藻糖、甜菜碱、D
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山梨醇、PVP360、甘油、DMSO以及BSA。
[0008]专利技术人发现一种特定组分组成的连接酶复合稳定剂，该稳定剂能够提升酶的稳定性，维持酶的冻融稳定性，同时可以提高片段和载体的连接效率，5
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10min即可完成反应。本专利技术提供的连接酶复合稳定剂用于分子克隆中连接酶的连接反应，通过连接目的片段和载体，进行转化，构建的转化子在冻融情况下，目的片段连接的菌落数和克隆阳性率均维持非常稳定，干冰冻融20次能够维持90％以上的阳性率，并且进行37℃加速14d的测试，目的片段连接的菌落数和克隆阳性率均优于其他厂家产品，效果稳定。
[0009]根据本专利技术的一些实施方案，所述连接酶复合稳定剂包括：
[0010]0.0001
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0.01％明胶、50
‑
300mM海藻糖、10
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200mM甜菜碱、10
‑
150mM D
‑
山梨醇、0.1
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2.5％ PVP360、5
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20％甘油、10
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20％ DMSO、100
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200μg/mL BSA。
[0011]本专利技术第二方面提供一种连接酶复合稳定剂预混液。根据本专利技术的一些实施方案，所述连接酶复合稳定剂预混液包括第一方面所述的连接酶复合稳定剂。
[0012]本专利技术提供的连接酶复合稳定剂预混液用于分子克隆，构建的转化子在冻融情况下，2kb连接的菌落数和克隆阳性率均维持非常稳定，干冰冻融20次能够维持90％以上的阳性率，并且进行37℃加速14d的测试，688bp和2kb连接的菌落数和克隆阳性率均优于其他厂家产品，效果稳定。
[0013]根据本专利技术的一些实施方案，所述连接酶复合稳定剂预混液进一步包括连接缓冲
液、增强剂和连接酶。
[0014]根据本专利技术的一些实施方案，所述连接缓冲液包括：Tris
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HCl、MgCl2、DTT以及ATP。
[0015]根据本专利技术的一些实施方案，所述增强剂包括：PEG8000和氯化铵高钴。
[0016]根据本专利技术的一些实施方案，所述连接酶为T4 DNA连接酶。
[0017]根据本专利技术的一些实施方案，所述连接缓冲液包括：50
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100mM Tris
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HCl、2
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30mM MgCl2、5
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35mM DTT、1
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5mM ATP。
[0018]根据本专利技术的一些实施方案，所述增强剂包括：5
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20％ PEG8000和0.5
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2mM氯化铵高钴。
[0019]根据本专利技术的一些实施方案，所述T4 DNA连接酶在所述连接酶复合稳定剂预混液中的终浓度为0.5
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2U/μl。
[0020]本专利技术第三方面提供一种连接酶试剂盒。根据本专利技术的一些实施方案，所述连接酶试剂盒包括第一方面所述的连接酶复合稳定剂或第二方面所述的连接酶复合稳定剂预混液。
[0021]本专利技术第四方面提供第一方面所述的连接酶复合稳定剂、第二方面所述的连接酶复合稳定剂预混液在制备连接酶试剂盒中的用途。
[0022]本专利技术第五方面提供第一方面所述的连接酶复合稳定剂、第二方面所述的连接酶复合稳定剂预混液、第三方面所述的连接酶试剂盒在分子克隆中的用途。
[0023]本专利技术第六方面提供一种分子克隆方法。根据本专利技术的一些实施方案，所述分子克隆方法包括：
[0024]利用第二方面所述的连接酶复合稳定剂预混液或第三方面所述的连接酶试剂盒进行载体和插入片段的连接，对连接产物进行转化和菌落鉴定，以便获得阳性克隆。
[0025]本专利技术提供的连接酶复合稳定剂预混液，所有组分都在一个反应体系中，采用一管式预混液，通过特殊稳定剂的加入，提高了片段和载体的连接效率，可在5
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10min内完成连接反应，并且操作简便，解决了T4 DNA连接酶和连接缓冲液混合后酶活不稳定的问题，提高保存稳定性，延长保质期。
[0026]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0027]本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0028]图1是根据实施例4进行的不同T4 DNA连接酶预混液终浓度的优化进行的2kb的菌落PCR检测结果；
[0029]图2是根据实施例5进行的不同T4 DNA连接酶预混液的冻融稳定性实验结果，进行的2kb的菌落PCR检测结果；
[0030]图3是根据实施例6进行的不同T4 DNA连接酶的加速稳定性和不同厂家对比实验结果，进行的688bp和2kb的菌落PCR检测结果。
具体实施方式
[0031]下面参考具体实施例，对本专利技术进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本专利技术。
[0032]实施例的实验中所用到的试剂，如无特殊说明，均可通过市售获得。
[0033]此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种连接酶复合稳定剂，其特征在于，包括：明胶、海藻糖、甜菜碱、D
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山梨醇、PVP360、甘油、DMSO以及BSA。2.根据权利要求1所述的连接酶复合稳定剂，其特征在于，所述连接酶复合稳定剂包括：0.0001
‑
0.01％明胶、50
‑
300mM海藻糖、10
‑
200mM甜菜碱、10
‑
150mM D
‑
山梨醇、0.1
‑
2.5％PVP360、5
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20％甘油、10
‑
20％DMSO、100
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200μg/mL BSA。3.一种连接酶复合稳定剂预混液，其特征在于，包括权利要求1或2所述的连接酶复合稳定剂。4.根据权利要求3所述的连接酶复合稳定剂预混液，其特征在于，进一步包括连接缓冲液、增强剂和连接酶；任选地，所述连接缓冲液包括：Tris
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HCl、MgCl2、DTT以及ATP；任选地，所述增强剂包括：PEG8000和氯化铵高钴；任选地，所述连接酶为T4 DNA连接酶。5.根据权利要求4所述的连接酶复合稳定剂预混液，其特征在于，所述连接缓冲液包括：50
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：邹爱兰，刘玉方，李晓晨，孙克非，
申请(专利权)人：天根生化科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：