一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法。该方法将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl0929基因失活后构建获得。本发明专利技术提供一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌株的构建方法，构建的重组菌株由于内源基因NCgl0929失活引起赖氨酸胞内转运速率明显降低，与野生型相比，该菌株更有利于生产高浓度的L‑赖氨酸，作为L‑赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法，属于生物技术

技术介绍
L-赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。L-赖氨酸为白色或近白色自由流动的结晶性粉末；几乎无臭。易溶于水和甲酸，难溶于乙醇和乙醚。L-赖氨酸分子结构中存在两个氨基碱性较强，C4位上的羧基酸性较弱，因此L-赖氨酸一般表现为碱性氨基酸。L-赖氨酸主要用作饲料添加剂、食品强化剂和制药。目前，可以通过不同的方法来生产L-赖氨酸，包括微生物发酵法(一步发酵法、两步发酵法)、酶法、蛋白水解法等。最常用的方法是微生物发酵法，是借助微生物具有生物合成自身所必需氨基酸的能力，利用微生物的代谢作用，通过对菌株进行改造，选育出各种氨基酸营养缺陷型和氨基酸结构类似物抗性突变株，从而解除生物合成途径中的反馈阻遏和抑制作用，达到过量积累代谢途径中L-赖氨酸的目的。用于生产L-赖氨酸的微生物包括多种属，如棒状杆菌(如谷氨酸棒状杆菌Coryne本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法，其特征在于，将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl0929基因失活后构建获得，NCgl0929基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法，其特征在于，将谷氨酸棒
状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的NCgl0929基因失活后构建获得，NCgl0929基因编
码框的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium
glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC23604。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)通过PCR扩增NCgl0929基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源
臂序列，NCgl0929基因编码框的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
(2)通过PCR扩增抗性标签基因片段；
(3)将步骤(1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠PCR
进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不
能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；
(4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨
酸棒状杆菌感受态细胞，即得。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增以谷氨酸
棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的基因组DNA为模板，PCR扩增引物的核苷酸序
列如下：
F1:CGGGATCCTCGTACTGTATCTATTAGAACCCT；
R1:AAGGCCAGCAAAAGCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72
℃延伸10min，4℃保存。
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿
梭质粒pHT01的DNA；PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
F2:GGGCTTTAGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；
R2:GCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
所述的PCR扩增程序如下：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞明，汪俊卿，王蕾，王腾飞，李桂华，王建彬，隋松森，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，诸城东晓生物科技有限公司，山东省饲料质量检验所，
类型：发明
国别省市：山东;37