一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法。该方法将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl0929基因失活后构建获得。本发明专利技术提供一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌株的构建方法，构建的重组菌株由于内源基因NCgl0929失活引起赖氨酸胞内转运速率明显降低，与野生型相比，该菌株更有利于生产高浓度的L‑赖氨酸，作为L‑赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法，属于生物技术

技术介绍
L-赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。L-赖氨酸为白色或近白色自由流动的结晶性粉末；几乎无臭。易溶于水和甲酸，难溶于乙醇和乙醚。L-赖氨酸分子结构中存在两个氨基碱性较强，C4位上的羧基酸性较弱，因此L-赖氨酸一般表现为碱性氨基酸。L-赖氨酸主要用作饲料添加剂、食品强化剂和制药。目前，可以通过不同的方法来生产L-赖氨酸，包括微生物发酵法(一步发酵法、两步发酵法)、酶法、蛋白水解法等。最常用的方法是微生物发酵法，是借助微生物具有生物合成自身所必需氨基酸的能力，利用微生物的代谢作用，通过对菌株进行改造，选育出各种氨基酸营养缺陷型和氨基酸结构类似物抗性突变株，从而解除生物合成途径中的反馈阻遏和抑制作用，达到过量积累代谢途径中L-赖氨酸的目的。用于生产L-赖氨酸的微生物包括多种属，如棒状杆菌(如谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum和钝齿棒杆菌Corynebacteriumcrenatum)、短杆菌(如黄色短杆菌Breibacteriumflavum和乳酸发酵短杆菌Brevibacteriumlactofermentus)、洛卡氏菌、念球菌、假单胞菌、埃希氏菌(如大肠杆菌Escherichiacoli)和芽孢杆菌(如浸麻芽孢杆菌Bacillusmacerans)、古生菌(如热变形菌Thermoprotensneutrophilus)以及真菌中的酵母菌(如隐球酵母Cryptococcusneoformans)等。目前，国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、黄色短杆菌(B.flavum)、乳酸发酵短杆菌(B.lactofermentus)和大肠杆菌(E.coli)的改造型菌株。国内外对L-赖氨酸生产菌种的选育主要通过诱变育种技术和代谢工程育种技术。代谢工程育种是从分子水平上通过最小限度的、最明确的基因改造来优化选育菌株。然而，与野生型菌株相比较，这些菌株存在很大的缺陷，如生长速度缓慢，糖耗速率低，对外界不良环境耐受力差等。随着生物技术的发展及谷氨酸棒状杆菌基因组的解析，传统诱变育种获得L-赖氨酸高产菌方法逐渐被代谢工程育种方法所取代。同时大量研究表明，通过基因工程技术获得的基因工程菌，除保留了野生型菌株的一些优点外，还能很大程度上提高L-赖氨酸产量。如中国专利文献CN1539015(申请号02815446.0)公开了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在内的多个可用于赖氨酸产量提高的基因改进位点。中国专利文献CN101600796(申请号200780048626.8)、CN1974760(申请号200610163142.5)、CN103243042(申请号201310092638.8)分别对基因NCg22534、NCgl1835、NCg21090进行失活获得一系列L-赖氨酸产率提高的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法。本专利技术通过改造菌株谷氨酸棒状杆菌获得，具体策略为失活谷氨酸棒状杆菌内源基因NCgl0929(编码赖氨酸胞内转运蛋白)以降低赖氨酸发酵过程中赖氨酸胞内胞外转运的冗余循环，使更多的能量流向L-赖氨酸合成方向，提高L-赖氨酸产率。术语说明本专利技术中，“失活”可以通过本领域已知的任何失活方法来诱导。“失活”产生的效果是指内源基因NCgl0929的表达被降低到很低的水平，或者产生不表达基因以及尽管被表达但表达不具有活性或活性降低的产物。本专利技术中，“失活”可以通过基因工程手段在内源基因NCgl0929中插入一个或多个碱基对，或者缺失该内源基因NCgl0929中的一个或多个碱基对，或者由基因内部序列转换或颠换获得。本专利技术技术方案如下：一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法，是将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的NCgl0929基因失活后构建获得，NCgl0929基因编码框的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术优选的，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC23604。根据本专利技术优选的，上述构建方法，步骤如下：(1)通过PCR扩增NCgl0929基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源臂序列，NCgl0929基因编码框的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)通过PCR扩增抗性标签基因片段；(3)将步骤(1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠PCR进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；(4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，即得。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的基因组DNA为模板，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F1:CGGGATCCTCGTACTGTATCTATTAGAACCCT；R1:AAGGCCAGCAAAAGCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿梭质粒pHT01(购自杭州宝赛生物科技有限公司)的DNA；PCR扩增引物的核苷酸序列如下：F2:GGGCTTTAGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；R2:GCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：所述的PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的第一阶段扩增体系如下，总体系为25μl：重叠PCR的第一阶段扩增程序如下：95℃预变性5min；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法，其特征在于，将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl0929基因失活后构建获得，NCgl0929基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法，其特征在于，将谷氨酸棒
状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的NCgl0929基因失活后构建获得，NCgl0929基因编
码框的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium
glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC23604。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)通过PCR扩增NCgl0929基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源
臂序列，NCgl0929基因编码框的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
(2)通过PCR扩增抗性标签基因片段；
(3)将步骤(1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠PCR
进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不
能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；
(4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨
酸棒状杆菌感受态细胞，即得。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增以谷氨酸
棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的基因组DNA为模板，PCR扩增引物的核苷酸序
列如下：
F1:CGGGATCCTCGTACTGTATCTATTAGAACCCT；
R1:AAGGCCAGCAAAAGCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72
℃延伸10min，4℃保存。
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿
梭质粒pHT01的DNA；PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
F2:GGGCTTTAGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；
R2:GCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
所述的PCR扩增程序如下：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞明，汪俊卿，王蕾，王腾飞，李桂华，王建彬，隋松森，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，诸城东晓生物科技有限公司，山东省饲料质量检验所，
类型：发明
国别省市：山东;37