使用粒酶B蛋白酶切割融合蛋白制造技术

通过使用粒酶Ｂ蛋白酶（ＥＣ　３．４．２１．７９）对融合蛋白进行酶切制备呈真实形式的目标多肽的方法。还提供了包含目标多肽和融合伴侣的融合蛋白，其中在目标多肽和融合伴侣之间的连接区包含紧邻目标多肽的粒酶Ｂ蛋白酶切割位点；还提供了人粒酶Ｂ蛋白酶变异体，其中第２２８号的（胰凝乳蛋白酶原编号）半胱氨酸残基突变为苯丙氨酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是通过使用粒酶B (Granzyme B)蛋白酶对重组产 生的融合蛋白进行酶切制备呈真实形式的目标多肽的方法。而且本发 明涉及包含粒酶B切割位点的融合蛋白以及人粒酶B变异体。本专利技术的背景和先有技术一般在蛋白质工程，特别是在制药领域中，以高度纯化和经过充 分研究的形式制备和纯化重组多肽例如药物蛋白，已经成为一项主要 任务。制备这种重组多肽常常依赖的技术涉及以融合或者杂合蛋白形式 生产多肽，其中目标蛋白质或者多肽与载体或者融合伴侣(如多肽或 者蛋白质)相融合。与目标多肽融合的融合伴侣或者载体的存在具有以下优势它可 以使融合蛋白具有更高的抗蛋白酶降解能力；可以促进表达和分泌； 可以提高溶解度并使融合蛋白能够进行随后的亲和纯化。而且，通过 融合蛋白表达，可能具有生物危害的物质例如肽类激素，可以以无活 性的形式产生，然后在体外通过切除融合伴侣使其激活。但是这种融合蛋白自身通常并不适宜作为最终产物，原因有融合 伴侣可能影响目标多肽的生物活性或者稳定性，并且如果将要在临床 使用该蛋白，可能会产生抗原性问题。因此有必要切除融合蛋白以释 放目标多肽。原则上这可以通过化学方法或者生化方法例如酶切来实现。但是 重要的是切割是高度特异的，且只发生在目标多肽和融合伴侣之间的 切割序列处，即连接区，但优选地不在目标多肽自身的内部，因为这 可能会例如严重影响目标多肽的生物活性。这种方法使用的试剂通过 肽键的水解发生作用，且切割试剂的特异性决定于位于或者靠近被切 割肽键的氨基酸残基的特性。切割融合蛋白的生化方法是以蛋白酶(蛋白水解酶)的使用为基 础的。但是如果切割位点特异的氨基酸同时出现在目标多肽自身的内 部，则融合蛋白的酶切就受到限制。因此，为了达到切割的目的，酶 不仅仅识别氨基酸，而是识别氨基酸序列，这才是特别适宜的，因为 识别和切割切割序列所需的氨基酸数目越多，该氨基酸序列除了在目 标多肽和融合伴侣之间存在以外还能够再次出现在目标多肽内部的概 率就越低。迄今为止已有数个蛋白酶用于融合蛋白的酶切，切割方法是使融 合蛋白与蛋白酶在适当条件下接触。WO 03/010204涉及的是使用泛素切割酶从融合蛋白上分离多肽， 根据此专利技术，泛素切割酶切割与在蛋白质(例如泛素)C端RGG氨基 酸序列相邻的肽键。US 6， 010， 883公开了一种方法，其中使用凝血因子Xa (EC 3. 4. 21. 6;通过对酶原因子X进行有限蛋白酶解形成的Sl丝氨酸型肽 酶)将融合伴侣从融合蛋白上切除。该蛋白酶在氨基酸序列 X-Y-Gly-Arg之后进行特异切割，其中X是lie, Leu, Pro或Ala，Y 是Glu, Asp, Gln或Asn。 Xa因子优选地在切割序列Ile-Glu-Gly-Arg 之后切割。在特异切割融合蛋白的方法中建议和使用的其它先有技术中的酶包括烟草蚀紋病毒NIa蛋白酶、胶原酶、肠激酶、枯草杆菌蛋白酶和 凝血酶。但是，在融合蛋白系统中使用蛋白酶切割可能会遇到许多问题。 一个主要的问题是对融合蛋白的非特异蛋白水解，这会导致在几个不 同位置的切割，结果使产物丢失，产生污染性的片段。而且目前已知 的酶经常会出现使融合蛋白不充分或者不完全切割。这种不充分切割 使产量下降，并且可能在纯化的蛋白中引入异质性，导致目标蛋白只 有一'J、部分被回收。另 一个与许多目前在融合蛋白切割上应用的酶相关的问题是切割 后的多肽产物(目标多肽)上经常连有假的或外来的氨基酸。当衔接 物被切掉时通常会存在这些氨基酸，无关的氨基酸残基可能对产生的 目标多肽的性质有所影响。这对于用于为治疗人类疾病生产的蛋白来 说可能是至关重要的。因此，非常需要产生没有外来氨基酸短序列或 者残基的真实的纯多肽。目标多肽在切割后仍然残留外来氨基酸的问题在美国专利 4， 543， 329中予以阐释，该专利描述了使用胶原酶对融合蛋白进行选 择性切割的过程。但是，使用这种酶在目标多肽的N端引入了外来氨 基酸序列Gly-Pro。为了获得真实形式的目标多肽，随后必须通过使 用 一种或者更多不同的氨肽酶(例如氨酰色氨酸氨肽酶和色氨酸氨肽 酶)在另一个反应步骤中除去这些外来氨基酸(Gly和Pro)。这一问题还在美国专利5, 427, 927中予以阐释，该专利描述了使 用IgA蛋白酶对融合蛋白进行序列特异切割的过程，其中IgA蛋白酶 的识别位点被插入到融合蛋白的连接区，随后用IgA蛋白酶切割融合 蛋白。IgA蛋白酶的识别位点是氨基酸序列Y-Pro4 X-Pro,其中X可以是任何氨基酸，Y可以是一个或者几个任意的氨基酸，l指明了切 割位点。但是在使用IgA蛋白酶切割后形成的目标蛋白在其N端具有 X-Pro外来氨基酸序列，即产生的目标多肽并不以其本来或者真实的 形式存在。目前用于融合蛋白切割的最广泛使用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶因 子Xa和凝血酶。但是，已知这两种酶对融合蛋白都有非特异性切割。 此外，因子Xa需要从牛血清中分离，所以在治疗性应用中用Xa因子 切割蛋白之后需要进行大量的纯化和分析以检测可能存在的病原性因 子如病毒和朊病毒(例如导致牛海绵状脑病的朊病毒)。而且，这些 酶相当昂贵。考虑到先有技术的缺点和不足之处，因此本专利技术的目的是提供一 种改进的方法用于切割融合蛋白。本专利技术的专利技术者发现可以通过使用粒酶B蛋白酶(EC 3. 4. 21. 79) 用于切割融合蛋白从而克服上述技术问题。因此，令人惊讶地发现粒 酶B蛋白酶可以对具有粒酶B蛋白酶切割位点的融合蛋白进行高效的 切割，并且具有高度的切割特异性。特别是已经证明粒酶B蛋白酶与 目前广泛使用的蛋白酶因子Xa相比对融合蛋白具有更高的特异性切 割。而且已经发现粒酶B在切割具有粒酶B识别序列的融合蛋白(粒 酶B识别序列的位置位于N端融合伴侣和C端目标多肽之间，其中切 割位点紧邻目标多肽)时产生的目标多肽没有来自切割位点的外来氨 基酸，即产生的是真实形式的多肽。这样可以通过粒酶B切割融合蛋 白产生具有本来氨基酸序列的重组目标蛋白。而且，粒酶B蛋白酶还 可以通过重组制备，这也是它的优势。最后还发现将人粒酶B中的笫 228号氨基酸(胰凝乳蛋白酶原编号)半胱氨酸替换为苯丙氨酸，在 制备重组人粒酶B时可以得到更高的最终蛋白质回收。专利技术概述因此本专利技术涉及的首先是制备真实形式目标多肽的方法。该方法包含以下步骤(i)提供融合蛋白，其按N端到其C端的顺序包含(a) 融合伴倡，(b)包含粒酶B蛋白酶切割位点的粒酶B蛋白酶识别位点以 及(c)目标多肽，其中所述的切割位点紧邻目标多肽；和(ii)使所述融 合蛋白与粒酶B蛋白酶(EC 3. 4. 21. 79)接触以在所述切割位点处切割 产生真实形式的所述目标多肽。另 一方面提供了融合蛋白，其按N端到其C端的顺序包含(a)融合 伴侣，(b)包含粒酶B蛋白酶切割位点的粒酶B蛋白酶识别位点以及(c) 目标多肽，其中所述的切割位点紧邻目标多肽。还提供了一个人粒酶B蛋白酶变异体，其中第228号的氨基酸(胰 凝乳蛋白酶原编号)半胱氨酸突变为苯丙氨酸。另一些方面本专利技术提供了编码这样的融合蛋白或者人粒酶B蛋白酶变异体的分离的核酸序列，包含该分离的核酸序列的重组载体，使 用这种载体转化的宿主细胞，以及制备融合蛋白或本文档来自技高网...

【技术保护点】
人粒酶Ｂ蛋白酶变异体，其中的２２８号（胰凝乳蛋白酶原编号）半胱氨酸残基突变为苯丙氨酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：RH劳伦森，CH芬波，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，阿纳福公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]