表达和分泌系统技术方案

本发明专利技术提供了表达和分泌系统，以及使用它们的方法，用于在原核细胞中表达和分泌一种融合蛋白质并且在真核细胞中表达和分泌第二种融合蛋白质。在本文中还提供了核酸分子、载体以及包含此类载体和核酸分子的宿主细胞。

Expression and secretion system

【技术实现步骤摘要】
表达和分泌系统本申请为2013年7月3日提交的，专利技术名称为“表达和分泌系统”的PCT申请PCT/US2013/049310的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2015年1月4日，申请号为201380035629.3。相关申请的交互引用本申请要求2012年7月5日提交的美国临时申请号61/668397、2013年3月15日提交的61/852483和2013年5月3日提交的61/819063的优先权的权益，所述全部专利申请在本文中以其整体引入作为参考。专利
本专利技术涉及表达和分泌系统及其使用的方法，用于当核酸转化到用于噬菌体展示的原核细胞时表达和分泌一种Fab融合蛋白质，并当核酸转染到用于表达和纯化的真核细胞时表达和分泌不同的或者相同的Fab融合蛋白质。在本文中还提供了核酸分子、载体以及包含此类载体和核酸分子的宿主细胞。专利技术背景多肽或蛋白质在丝状噬菌体颗粒上的噬菌体展示是允许从多种肽或蛋白质的大型库中挑选具有期望特性的肽或蛋白质的体外技术(McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)；Sidhu等人,CurrentOpinioninBiotechnology,11:610-616(2000)；Smith等人,Science,228:1315-1317(1985))。可将噬菌体展示用于在丝状噬菌体颗粒的表面展示肽或蛋白质(包括抗体片段如抗体研发领域的Fab)的不同文库，然后挑选与特定的目的抗原结合的。可以通过将抗体片段的基因与噬菌体外壳蛋白的基因融合，将抗体片段展示在丝状噬菌体颗粒的表面上，产生在其表面展示编码的抗体片段的噬菌体颗粒。该技术允许从大型噬菌体文库中分离与多种抗原具有期望亲和力的抗体片段。对于基于噬菌体的抗体研发，在功能测定法(例如目标结合、基于细胞的活性测定、体内半衰期等)中评价挑选的抗体片段及其同源IgG的特性需要通过从用于噬菌体展示的载体中分离编码HC和LC的DNA序列，并亚克隆到用于IgG表达的哺乳动物表达载体中，来将Fab重链(HC)和轻链(LC)序列重新格式化成全长IgG。亚克隆数十或数百个挑选的HC/LC对的费力方法代表了基于噬菌体的抗体研发方法的主要瓶颈。此外，一旦重新格式化，由于在最初的筛选测定中相当比例挑选的Fab没有令人满意地施行，那么增加进行该重新格式化/筛选方法的克隆的数目将极大地增加成功的最终可能性。在本文中，我们描述了表达和分泌系统的产生，用于当转化到大肠杆菌中时驱动Fab-噬菌体融合的表达，并当转染到哺乳动物细胞中时驱动包含相同Fab片段的全长IgG的表达。我们证明，来自鼠结合免疫球蛋白(mBiP)的哺乳动物信号序列(Haas等人,Immunoglobulinheavychainbindingprotein,Nature,306:387-389(1983)；Munro等人,AnHsp70-likeproteinintheER:identifywiththe78kdglucose-regulatedproteinandimmunoglobulinheavychainbindingprotein,Cell,4:291-300(1986))可以在原核和真核细胞二者中驱动有效的蛋白质表达。使用哺乳动物mRNA剪接，去除在人IgG1HC的铰链区内插入的含噬菌体融合肽的合成的内含子，我们可以以宿主细胞依赖性方式产生两种不同的蛋白质：用于在大肠杆菌中噬菌体展示的与接头肽融合的Fab片段和哺乳动物细胞中的天然人IgG1。该技术允许挑选与来自噬菌体展示文库的目的抗原结合的Fab片段，并且可以在不需要亚克隆的情况下，在哺乳动物细胞中后续表达同源全长IgG并纯化。专利技术概述在一个方面，本专利技术部分基于以下实验发现(1)非原核来源的信号序列可以在原核细胞中发挥功能和(2)当mRNA加工在真核细胞，而不是原核细胞中发生时，可以以宿主细胞依赖性方式从相同的核酸分子中表达不同的Fab融合蛋白质(原核细胞中的Fab-噬菌体融合蛋白质和真核细胞中的Fab-Fc融合蛋白质)。因此，本文中描述的是这样的核酸分子以及使用方法，当将核酸转化到原核宿主细胞(例如大肠杆菌)中时在细菌中表达和分泌与用于噬菌体展示的噬菌体颗粒蛋白质、外壳蛋白或者接头蛋白融合的Fab片段，以及当将核酸转化到真核细胞(例如哺乳动物细胞)中时，在不需要亚克隆的情况下，与Fc融合的Fab片段。在一个实施方案中，本专利技术提供了这样的核酸分子，其编码包含可变重链结构域(VH)的VH-HVR1、VH-HVR2和HVR3的第一多肽和/或包含可变轻链结构域的VL-HVR1、VL-HVR2和VL-HVR3的第二多肽，并且其中该核酸分子还编码在原核和真核细胞二者中发挥功能的信号序列，并且其由与第一和/或第二多肽序列有效连接的核酸序列编码，并且其中全长抗体表达自核酸分子的第一和/或第二多肽。在另一个实施方案中，第一和/或第二多肽还包含可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。在另外的实施方案中，VH结构域与CH1连接，并且VL结构域与CL连接。在一个方面，本专利技术提供了这样的核酸分子，其编码可变重链结构域(VH)的VH-HVR1、VH-HVR2和VH-HVR3以及可变轻链结构域(VL)的VL-HVR1、VL-HVR2和VL-HVR3，并且包含原核启动子和真核启动子，所述启动子与VH的HVR和/或VL的HVR有效连接，以允许在原核和真核细胞中表达VH的HVR和VL的HVR，并且其中当通过真核细胞表达时，VH和/或VL的HVR与效用肽(utilitypeptide)连接，并且其中核酸还编码在原核和真核细胞二者中发挥功能的信号序列。在另一方面，本专利技术提供了这样的核酸分子，其编码可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域，并且包含原核启动子和真核启动子，所述启动子与VH结构域和/或VL结构域有效连接，以允许在原核和真核细胞中表达VH结构域和/或VL结构域，并且其中当通过真核细胞表达时，VH结构域和/或VL与效用肽连接，并且其中核酸还编码在原核和真核细胞二者中发挥功能的信号序列。在一个实施方案中，VL和VH与效用肽连接。在另外的实施方案中，VH还与CH1连接，并且VL与CL连接。效用肽选自Fc、标签、标记和对照蛋白质(controlprotein)。在一个实施方案中，VL与对照蛋白质连接，并且VH与Fc连接。例如，对照蛋白质是gD蛋白质或其片段。甚至在另外的实施方案中，本专利技术的第一和/或第二多肽与下述物质融合：外壳蛋白(例如，噬菌体M13、f1或fd的pI、pII、pIII、pIV、pV、pVI、pVII、pVIII、pIX和pX或其片段例如pIII蛋白质的氨基酸267-421或262-418(除非另外指明，当在本文中使用时，“pI”、“pII”、“pIII”、“pIV”、“pV”、“pVI”、“pVII”、“pVIII”、“pIX”和“pX”指全长蛋白质或其片段))、或者接头蛋白(例如亮氨酸拉链蛋白质或包含或的氨基酸序列的多肽)或其变体(修饰了SEQIDNO:12和SEQIDNO:13中的氨基酸，包括但不限于那些以下划线和黑体表示的氨基酸)，其中变体具有氨基酸修饰，其中修饰保留或者增加了接头蛋白与另本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸分子，其编码包含可变重链结构域(VH)的VH‑HVR1、VH‑HVR2和VH‑HVR3的第一多肽和/或包含可变轻链结构域(VL)的VL‑HVR1、VL‑HVR2和VL‑HVR3的第二多肽，并且其中所述核酸分子还编码在原核和真核细胞二者中都发挥功能的信号序列，并且所述信号序列通过与所述第一和/或第二多肽序列有效连接的核酸序列编码，并且其中从所述核酸分子的所述第一和/或第二多肽中表达全长抗体。

【技术特征摘要】
2012.07.05 US 61/668,397;2013.03.15 US 61/852,483;1.核酸分子，其编码包含可变重链结构域(VH)的VH-HVR1、VH-HVR2和VH-HVR3的第一多肽和/或包含可变轻链结构域(VL)的VL-HVR1、VL-HVR2和VL-HVR3的第二多肽，并且其中所述核酸分子还编码在原核和真核细胞二者中都发挥功能的信号序列，并且所述信号序列通过与所述第一和/或第二多肽序列有效连接的核酸序列编码，并且其中从所述核酸分子的所述第一和/或第二多肽中表达全长抗体。2.核酸分子，其编码可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域，并且包含原核启动子和/或真核启动子，所述启动子与所述VH结构域和/或VL结构域有效连接，以允许在原核和真核细胞中表达VH结构域和/或VL结构域，并且其中当通过真核细胞表达时，所述VH结构域和/或VL与效用肽(utilitypeptide)连接，并且其中所述核酸还编码在原核和真核细胞二者中都发挥功能的信号序列。3.载体，其包含权利要求1或2所述的核酸分子。4.用权利要求3所述的载体转化的宿主细胞。5.用于产生抗体的方法，包括培养权利要求4所述的宿主细胞，以使所述核酸表达。6.接头蛋白，其包含SEQIDNO:8、9、12、13、14或15的氨基酸序列的至少一个残基的修饰。7.编码权利要求6的接头蛋白的核酸分子。8.分离的核酸分子，其编码在原核和真核细胞二者中发挥功能的mBIP多肽，所述mBIP多...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·特萨，X·陈，M·丹尼斯，I·霍特策尔，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH