制备可产生特异性抗ＨＩＶ抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法技术

提供了产生能与ＨＩＶ核心抗原Ｐ５５即ｇａｇ基因编码之前体蛋白、核心蛋白Ｐ２４及部分分解产物Ｐ３９和Ｐ３３结合的单克隆抗体的杂交细胞系。本发明专利技术的单克隆抗体并不与Ｐ１８核心蛋白或任何ＨＩＶ被膜抗原结合。本发明专利技术的细胞系是经特殊的免疫程序建立的，其中使用一组选择的免疫原经一系列多重输注免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，并用一常规使用的骨髓瘤细胞系与收获的小鼠脾细胞融合。该单克隆抗体被鉴定为ＫＣ－５７抗体。其特别适用于固相免疫检测法中，其中测定的是与病人血清或血浆样品中ＨＩＶ抗原结合的单克隆抗体。（*该技术在2008年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及以杂交瘤技术生产的单克隆抗体，特别是涉及产生一种独特之单克隆抗体的细胞系，所说的单克隆抗体识别一组自不同地区分离的人免疫缺陷病毒(HIV)gag编码蛋白的抗原决定基。已经认识到，目前大多称为人免疫缺陷病毒(“HIV”)的Ⅲ型人T细胞白血病病毒(HTLVⅢ)是人类免疫缺陷综合症(即爱滋病，ADIS)的致病因子。鉴于爱滋病在美国和其它一些国家造成一定比例的流行这一慢性感染特征，而对其作了广泛的研究并努力开发了检测人外周血中爱滋病病毒抗原及相应抗体的可靠而稳定的免疫诊断方法。在实际检测中，也已反过来将单克隆抗体用于发展这类免疫检测法。HIV属于还原病毒类。还原病毒携带一正链RNA并在其核心中有一特异的逆向转录酶，其被用于将病毒RNA转化为DNA。与该过程相反的典型细胞转录过程则是将DNA转化为RNA。已知HIV结合于T4淋巴细胞上，因为T4淋巴细胞表面上的T4蛋白质可作为HIV的受体或结合位点(DalgleishAG等，Nature321∶763-767(1985))。HIV还能结合并攻击其他细胞，如单核细胞、组织巨噬细胞和脑、脊髓及外周神经系统中的细胞。HIV的生活史要求病毒通过性活动或输血等途径进入宿主病人的体内，然后结合于单核细胞或淋巴细胞的受体上。病毒穿透细胞并脱去其被膜或蛋白衣壳，以使其病毒RNA核心暴露。逆转录酶使病毒RNA核心转化为DNA，进而整合到宿主细胞基因组中。在其中大量产生新的病毒颗粒，直至宿主细胞膜被破坏，以向人血循环中释放出新的病毒颗粒。HIV系由形成封闭膜或被膜的蛋白质及包被病毒RNA抗原的核心组成。膜上和核心材料中有被表达的抗原;核心具有大部分组成病毒的蛋白质。虽然广泛使用并在理论上了解了生成单克隆抗体的常规技术，但也充分认识到了生产特异性抗体的尝试中所遇到的不少复杂情况和变化。涉及开发和生产特异性单克隆抗体的每项研究工作均会遇到各自不同的障碍而难于取得成功。任何一个特定课题能否取得成功，在很大程度上与所用抗原的性质以及用于细胞融合和分离适宜杂交瘤细胞的技术有关。对于生产分泌抗HIV特异性单克隆抗体的细胞系来说，这些障碍特别明显。HIV系由具有无数抗原决定基的被膜及表达无数抗原位点的核心蛋白所组成，由此便可很容易地了解到，骨髓瘤细胞与被免疫小鼠的脾细胞的寻常融合将产生多达用天文数字计数的杂交瘤细胞，且此后筛选特异性抗体的工作将更为繁复。Ferns等人(J.Gen.Virol.，68∶1543-1551(1987-GreatBritain))研究了识别HIV分离物之病毒蛋白的单克隆抗体。制得了抗HIV之gag蛋白的单克隆抗体。用Western吸印法鉴定了一组单克隆抗体，证实由这些单克隆抗体识别的HIVgag蛋白是分子量为55，000道尔顿(p55)、24，000道尔顿(p24)、18，000道尔顿(p18)的蛋白质，其均为核心抗原。在Serki等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，80∶3618-3622(1983))的研究中，已测定了HIV整个基因组的核苷酸顺序。这一研究表明，HIV被膜基因表达不同的糖基化蛋白，且核心蛋白不是糖基化的蛋白。Ferns等人(上述文献)的研究则表明，HIV被膜基因的糖基化蛋白被鉴定为分子量为160，000道尔顿的gp160、分子量为120，000道尔顿的gp120和分子量为41，000道尔顿的gp41。这期间利用单克隆抗体检测人体是否患有爱滋病或是否与能被鉴定的病毒有过免疫学上的接触，但这些商业上可行的诊断试验尚未完全获得成功。因为在疾病表现出症状之前，需要进行这期间的保温处理，而使得对该病的诊断变得极为复杂。鉴于该病的高度感染性质以及就目前的科学水平尚不能治疗该疾病这一事实。也增加了研究活病毒及其对人类免疫系统之有害影响以发展成功的诊断试验的困难。为此，本专利技术提供了一种产生能与病毒核心中选择的主要蛋白结合的新的单克隆抗体的杂交瘤或杂交细胞系。该单克隆抗体可稳定而可靠地识别某些HIV核心抗原的共同抗原决定基，故可将所说的抗体用于免疫检测法中，以高度准确地追踪人生理性血清样品中的HIV病毒抗原。该单克隆抗体不与HIV被膜抗原结合。另外，本专利技术描述了以杂交瘤技术制得的细胞系，该细胞系可产生与HIV核心抗原p55(其为gag基因编码的前体蛋白)、核心蛋白p24及部分分解产物p39和p33结合的单克隆抗体。本专利技术的单克隆抗体不结合p18核心蛋白或任何HIV被膜抗原。单克隆抗体识别本文鉴定为“KC-57”抗原的p55、p24、p39和p33抗原上的共同抗原决定基。本专利技术的细胞系是用独特的免疫程序建立的，其中使用一组选择的免疫原，经一系列多点输注免疫BALB/C小鼠并以常用的骨髓瘤细胞系与收获的小鼠脾细胞进行融合。寄存声明产生本专利技术之KC-57单克隆抗体的细胞系已于1987年11月6日提交本专利申请的同时寄存于美国典型培养物保藏中心(Rockville，Maryland20852)。该细胞系的寄存登记号为A.T.C.C.N.HB9585。材料和方法病毒分离物由淋巴腺病毒(LAV)感染的细胞系中制备用于免疫小鼠的抗原。以分子排阻层析法由培养上清中分离全病毒。并用TritonX-100溶解LAV，然后过小扁豆植物凝血素亲合柱吸附之，以由培养上清中制备病毒提取物。经Western印迹分析显示由甲基-α，D-吡喃甘露糖苷洗脱的抗原主要是病毒被膜蛋白(gp160/120)，另外存在某些核心抗原(p55、p24)。杂交瘤细胞系的生产将分离的LAV感染的细胞系与完全弗氏佐剂乳化后用于腹腔内免疫雄性BALB/C小鼠。然后再给小鼠腹腔内注射三次纯化的病毒(在不完全弗氏佐剂的乳悬液中)，每次间隔一周。经这些注射后使小鼠每隔一周接受一次gp160/120病毒提取物免疫，共三次。第三次注射gp160/120后三天，切除一只小鼠的脾脏并制备脾细胞悬液。然后在使脾细胞在聚乙二醇1500存在下与骨髓瘤细胞融合。将融合的细胞铺敷于96小井组织培养板上，并用HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)培养基选择抗体生成杂交瘤细胞(Nature256∶495-497，1975)。细胞群落的筛选用俘获ELISA法鉴定产生抗HIV核心抗原之抗体的细胞群落。将识别HIV核心抗原的人抗体吸附于96小井聚苯乙烯检测板上。用牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点后，将去污剂破坏的LAV与检测板一起保温。然后洗涤平板并在检测平板之小井内加入各杂交瘤细胞群落的条件培养基。保温后，洗涤平板，加入过氧化物酶连接的羊抗小鼠IgG+IgA+IgM并保温。再次洗涤各小井，并加入底物四甲基联苯胺(TMB)。用H2SO4终止反应并测定450nm处吸光率。经鉴定，含KC-57的阳性细胞群落之吸光率比阴性细胞群落的吸光率至少高3倍。克隆到软琼脂胶中以扩充阳性细胞群落，然后注入姥鲛烷(pristane)刺激的BALB/C小鼠体内，以使之产生含抗体的腹水液。KC-57的特性经Ouchterlony免疫双扩散法测知KC-57的免疫球蛋白亚类为IgGl。完成Western吸印实验以测定被KC-57识别的抗原的分子量。用LAV感染之细胞的溶胞产物作为这一分析的抗原来源。抗原阴性对照是未感染T细胞的溶胞产物。证明对本文档来自技高网...

【技术保护点】
以杂交瘤技术建立的细胞系，其可产生识别一组有共同抗原决定基的ＨＩＶ核心抗原，且基本上不识别ＨＩＶ被膜抗原的ＫＣ－５７单克隆抗体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：肯尼斯H柯特里特，大卫E霍夫汉兹，卡罗琳苏利万，加里P托德特，
申请(专利权)人：科特公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]