编码狂犬病毒糖蛋白的基因片段，利用所述基因片段表达的重组的狂犬病毒糖蛋白，该蛋白非常适用于制备狂犬病疫苗和诊断试剂，以及一种制备狂犬病毒糖蛋白的方法，该方法包括将插有编码狂犬病毒糖蛋白的基因片段的穿梭载体导入真核细胞中，所述基因片段插在能在真核细胞中作用的启动子的下游，以及培养所述转化细胞，以在所述细胞的胞质中产生狂犬病毒糖蛋白。由于Ｇ蛋白能在胞质中以颗粒形式表达，而不与细胞膜结合，因此本发明专利技术的方法能以高产率和高纯度产生所需的Ｇ蛋白。（*该技术在2008年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及可用于狂犬疫苗或其他诊断试剂的狂犬病毒糖蛋白。更具体说，本专利技术涉及编码狂犬病毒糖蛋白的基因片段，通过表达所述基因片段而制备的重组的狂犬病毒糖蛋白，以及制备所述狂犬病毒糖蛋白的方法。狂犬病是人类已知的最古老的疾病之一，对于人类和其他哺乳动物都是一种相当危险的传染性疾病，它在所有感染此疾病的哺乳动物中都能导致100%的死亡率。日本具有下述有利条件的优越性即它是一个岛国，并已经对狗类实施了狂犬病预防措施(狗类是这种人类疾病的主要携带者)，而且每年都进行预防性注射。其结果是，此疾病已在1957年被成功地根除了。从那以后的约30年内，日本在根除狂犬病方面在世界上具有很高的地位，也就是说，没有发生所述疾病。然而，狂犬病仍然流行于世界，日本只不过是根除了狂犬病的一个相当罕见的例子。根据世界卫生组织1982年的统计数据，狂犬病在越南、泰国、菲律宾、印度、巴西、厄瓜多尔及类似国家流行很盛，并估计仅在印度一个国家，每年就有多达50，000人死于狂犬病。而且即使在日本，狂犬病问题也并未完全解决，对于去外国的游客(尤其是东南亚)来说，注射狂犬病疫苗仍是一种很重要的预防性接种。回顾一下狂犬病疫苗的发展历史将会发现，狂犬病疫苗的发展首先起于法国巴斯德研究所的减毒疫苗，其次是由哺乳动物脑制备的失活疫苗及其部分纯化的疫苗，进一步是利用哺乳动物或鸟类的培养细胞通过细胞培养制备的疫苗。但所有这些疫苗都是第一代疫苗，并仍然具有安全及生产率等方面的问题。Nishigahara菌株衍生物是一种适于制备动物和人疫苗的病毒株，它对于当代日本的狂犬病根除作出了巨大贡献。此病毒株是通过修改巴氏固定的狂犬病疫苗而制备的，后者是由法国巴斯德研究所制备的。也就是说，由于巴氏固定的狂犬病毒在兔中传代时的潜伏期为5至6天，Kondo等人(JapanMnistryofAgricultureandForestry，NishigaharaAnimalPlagueResearchInstitute)将此病毒分别在小豚鼠和兔中培养了大约90代，所得到的固定病毒的潜伏期缩短至3至4天，这在当时是最短的(JuekiChosashoKenkyuHokoku，AnimalPlagueResearchInstituteStudyReport，第1期，1918年8月出版)。迄今已知的其他典型的狂犬病毒包括ERA株、CVS株、PV株等等。已经证实，这些狂犬病毒结构相同，都是由五种蛋白质即L、G、N、M1和M2构成。在这些病毒的构成蛋白中，已知G蛋白是一种制备疫苗的有效物质(Wiktor等人，J.Immunol.110269-276，1973)。近年来，已经制备了针对狂犬病毒每种构成蛋白的单克隆抗体，从而能够在还未确定的狂犬病毒株之间进行比较。Flamand等人(J.Gen.Virol.48105-109，1980)比较了若干狂犬病毒产生中和性抗体的能力，并比较了单克隆抗体对于与G蛋白相关的感染的预防作用，结果表明，G蛋白中至少存在有14个抗原决定簇，而且，通过这些反应型的比较能够使狂犬病毒株相互区别。此后，许多研究者利用一系列针对N蛋白的单克隆抗体，研究了由世界各地分离的街道狂犬病毒的抗原性。结果发现，在许多情况下，病毒的抗原性与分离它的地区或动物有关。由这些事实可产生一个严重问题，即仅仅一株疫苗不大可能预防全世界的狂犬病。然而，本专利技术的狂犬疫苗是由Nishigahara株产生的，而如上所述日本已经根除狂犬病这一事实已证明了这一菌株的优越性。迄今为止，已经报导了一些利用基因重组技术表达狂犬病毒蛋白的试验，尤其是G蛋白。例如，L.T.Lawence等人(Vaccine84203-208，冷泉港实验室编)报导，一个编码狂犬病毒ERA株糖蛋白的基因被导入大肠杆菌(EscherichiaColi)的表达系统中进行表达，结果虽然糖蛋白基因在大肠杆菌中得到了表达，但由于宿主细胞是大肠杆菌而未发生糖基化作用，因此没有得到能作为有效免疫原的抗原。E.Yelverton等人(Science219614-619，1983)也报导了一个利用大肠杆菌表达狂犬病毒糖蛋白的实验。此报导没有给出任何已得到有效抗原的结果。此后，如日本专利公开(PCT)500949/1986所报导，在真核细胞如酵母或动物细胞中进行了G蛋白表达的尝试。虽然此报导描述了糖基化G蛋白的表达，但它没有给出任何用动物进行的免疫测试的结果。正如上面的报导所指出，虽然成功地进行了G蛋白本身的表达，但从应用的观点看来，目前还未发展出一种利用这些G蛋白的有效的狂犬疫苗。在这种情况下，本专利技术者通过应用基因重组技术进行了充分研究，企图发展出一种比第一代传统的狂犬疫苗更为安全有效的狂犬病毒疫苗。结果发现，通过本专利技术的基因重组技术能够得到所的狂犬糖蛋白，所述技术是指，克隆编码由Nishigahara株产生的狂犬病毒G蛋白的cDNA，将克隆的互补DNA(cDNA)插入真核细胞的表达载体中，以在真核细胞中进行表达。根据该方法，所需的狂犬病毒糖蛋白能在真核细胞中很好地表达。并且还证实了所表达的糖蛋白是一种有效疫苗。根据本专利技术利用基因重组技术制备狂犬病毒糖蛋白的方法，所需的糖蛋白是在胞质的局部进行表达，而不与转化细胞的细胞膜结合，对所需糖蛋白进行有效的表达时，几乎不影响转化细胞的代谢，而且能够很容易地纯化蛋白质。这样得到的本专利技术的糖蛋白不仅能与具有狂犬病毒中和活性的单克隆抗体发生反应，还能够诱导产生这样的抗体，它具有在用所述糖蛋白免疫的动物体内中和狂犬病毒的活性。因此，已证实本专利技术的糖蛋白可用于制备疫苗或诊断试剂。附图说明图1显示了编码本专利技术者克隆的狂犬病毒G蛋白的结构基因顺序和与之相接的基因顺序，以及由此推导出的氨基酸顺序。图2显示了在狂犬G-cDNA的制备中腺苷酸串的去除。图3显示了以COS细胞作为宿主的表达载体，pSVL-N913的构建。图4显示了COS细胞形态变化的照片，其中，COS细胞中表达的狂犬G蛋白由荧光反应显示。图5显示了酵母表达载体pAMN913的构建。本专利技术所用的狂犬病毒株如前所述产生于Nishigahara株，后者通过在兔中传代保存，到目前已传了2000多代(下面称为“N.HL株”)。本专利技术编码狂犬病毒G蛋白的基因片段(G-cDNA)是一个含有1575碱基对的基因片段，它在图1所示的碱基对中始于起始密码ATG，一直到终止密码TGA，或是一个含有与其等同的基因顺序的基因片段，或是一个含有部分该基因的基因，它基本上编码上述基因片段中的抗原决定簇。利用常规的基因克隆技术，例如利用Gubler和Hoffman的方法(Gene25263-269，1983)，由狂犬病毒N.HL株能够克隆到本专利技术的G-cDNA。本专利技术者已以大肠杆菌DH5α/pUC-N913寄存了一株大肠杆菌，它含有的质粒中掺入有狂犬病毒N.HL株的G-cDNA，它是根据布达佩斯条约以“FERMBP-1613”寄存于日本工业科技署的发酵研究所。根据图1所示的碱基对，本专利技术的G-cDNA也可利用DNA合成仪(如AppliedBiosystemCo.，Ltd.制造的381A型)合成所需的1575碱基对或其必需部分而制备。G-cDNA能被掺入适当的载体中，然后导入本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有全部或部分下述编码狂犬病毒糖蛋白的碱基顺序或与其等同的碱基顺序的基因片段：１０，２０，３０，４０，５０ＡＴＧＧＴＴＣＣＧＣ－ＡＡＧＣＴＣＴＴＣＴ－ＧＣＴＴＧＴＡＣＣＣ－ＡＴＴＣＴＧＧＧＴＴ－ＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧ－（６０）（７ ０）（８０）（９０）（１００）ＴＴＴＣＧＧＧＡＡＡ－ＴＴＣＣＣＴＡＴＴＴ－ＡＣＡＣＧＡＴＡＣＣ－ＡＧＡＣＡＣＡＣＴＴ－ＧＧＴＣＣＣＴＧＧＡ－（１１０）（１２０）（１３０）（１４０）（１５０）ＧＣＣＣＧＡＴＣＧＡ－ＴＡＴＡＣＡＴＣＡＴ －ＣＴＣＡＧＴＴＧＣＣ－ＣＡＡＡＣＡＡＴＴＴ－ＧＧＴＴＧＴＡＧＡＧ－（１６０）（１７０）（１８０）（１９０）（２００）ＧＡＣＧＡＡＧＧＴ－ＧＣＡＣＣＡＡＣＣＴ－ＧＴＣＡＧＧＧＴＴＣ－ＴＣＣＴＡＣＡＴＧＧ－ＡＡＣＴＴＡＡＡＧＴ－（２１０） （２２０）（２３０）（２４０）（２５０）ＴＧＧＡＣＡＣＡＴＣ－ＴＣＡＧＣＣＡＴＡＡ－ＡＧＧＴＧＡＡＣＧＧ－ＧＴＴＣＡＣＴＴＧＣ－ＡＣＧＧＣＧＴＴＧ－（２６０）（２７０）（２８０）（２９０）（３００）ＴＡＡＣＡＧＡＧＧＣ－ＡＧＡＡＡＣ ＣＴＡＣ－ＡＣＴＡＡＣＴＴＴＧ－ＴＴＧＧＴＴＡＴＧＴ－ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴ－（３１０）（３２０）（３３０）（３４０）（３５０）ＴＴＣＡＡＡＧＡＡ－ＡＧＣＡＴＴＴＣＣＧ－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡ－ＧＡＴＧＣＴＴＧＴＡ－ＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡ －（３６０）（３７０）（３８０）（３９０）（４００）ＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣ－ＡＴＧＧＣＣＧＧＴＧ－ＡＣＣＣＣＡＧＡＴＡ－ＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴ－ＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣ－（４１０）（４２０）（４３０）（４４０）（４５０）ＣＧＴＡＣＣＣＴ ＧＡ－ＣＴＡＣＣＡＴＴＧＧ－ＣＴＴＣＧＡＡＣＴＧ－ＴＡＡＡＡＣＣＡＣ－ＡＡＡＧＧＡＧＴＣＣ－（４６０）（４７０）（４８０）（４９０）（５００）ＣＴＣＧＴＴＡＴＣＡ－ＴＡＴＣＴＣＣＡＡＧ－ＴＧＴＧＧＣＡＧＡＴ－ＴＴＧＧＡＣＣＣＡＴ－ＡＴＧ ＡＡＣＴＣ－（５１０）（５２０）（５３０）（５４０）（５５０）ＣＣＴＴＣＡＣＴＣＧ－ＡＧＧＧＴＣＴＴＣＣ－ＣＴＡＧＣＧＧＡＡＡ－ＧＴＧＣＴＣＡＧＧＡ－ＡＴＡＡＣＡＧＴＡＴ－（５６０）（５７０）（５８０）（５９０）（６００）ＣＴＴ ＣＴＧＴＣＴＡ－ＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴ－ＡＡＣＣＡＣＧＡＴＴ－ＡＣＡＣＣＧＴＴＴＧ－ＧＡＴＧＣＣＴＧＡＡ－（６１０）（６２０）（...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：坂本信一，井手敏雄，时吉幸男，山元通孝，
申请(专利权)人：财团法人化学及血清疗法研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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