ＨＩＶ人体免疫缺陷病毒结合蛋白的表达制造技术

由ＣＤ－４受体蛋白衍生的ＨＩＶ结合蛋白在重组宿主细胞中的表达。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及由CD-4(sCD-4)可溶蛋白衍生的HIV结合蛋白的制造方法，更具体地说涉及用于HIV结合蛋白在大肠杆菌、链霉菌和酵母中表达的载体的构建。人体T细胞糖蛋白CD-4(以前有时称为“T4”)是若干非多形T淋巴细胞表面受体蛋白中的一种，这类蛋白与T细胞和靶细胞之间的有效中介作用有关。人们已经知道人体CD-4(T-4)受体的cDNA序列(Maddon，et.al.，Cell，42∶93，1985)。CD-4前体蛋白的完整序列其长度达458个氨基酸，包括公认的23个氨基酸的分泌前导部分，372个氨基酸的表面(V-V)，23个氨基酸的跨膜和40个氨基酸的细胞原生质结构区。该表面结构区有四个区，有限对应(20～30%)于免疫球蛋白可变(V)和接合(J)区。在表面结构区的五个内含子-外显子界面中有四个界面位于V-J这些区域接合部位附近。人体免疫缺陷病毒(HIV)即获得性免疫缺陷综合症(爱滋病AIDS)的病因剂对CD-4淋巴细胞具有显著的亲和性。病毒与CD-4的结合由病毒被膜的gp120糖蛋白起中介作用。CD-4蛋白是由溶解HIV感染的细胞与抗env抗体共沉淀得到的，与此相反，gp120可以与抗CD-4单克隆抗体共沉淀，因此可以说明病毒与CD-4的结合由病毒被膜的gp120糖蛋白起中介作用。近来有许多科学研究工作者报导了他们采用在哺乳动物细胞体系中表达的CD-4衍生物对关于CD-4和爱滋病感染之间相互作用的发现。Deen等(Nature，331∶82，1988)报导了sCD-4在若干细胞环境中的分离和表达。sCD-4是缺失CD-4跨膜和细胞原生质结构区的CD-4可溶衍生物。用中国仓鼠卵巢(CHO)dfhr缺失细胞系业已证明被表达的sCD-4保留着CD-4在细胞表面上的结构和生物学特征、与HIVgp110被膜蛋白的结合，并且能够抑制CD-4淋巴细胞的结合。Trauneker等(Nature，331∶84，1988)报导了采用sCD-4抑制病毒对靶细胞的粘附。给出的数据说明，采用sCD-4的重组形式能够抑制HIV的体外感染。Fisher等(Nature，331∶76，1988)报导了sCD-4从CHO的纯化并可用作病毒复制和病毒诱导细胞融合的有效抑制剂。Hussey等(Nature，33∶78，1988)报导了将baculo病毒表达系统用于产生sCD-4，并已发现通过与gp120表达细胞能够抑制病毒诱导细胞的融合(合胞体的形成)和HIV的感染。此外，还证明sCD-4蛋白似乎并无抑制Ⅱ型特异T细胞的作用。Smith等(Science，238∶1704，1987)还报导了将CHO哺乳动物细胞体系用于产生sCD-4。他们报导了在CHO细胞蛋白结合并抑制HIV-1在体外的感染。数据说明sCD-4能够用作治疗爱滋病感染的基础。但是，仍然需要用于表达sCD-4蛋白的细菌和低等真核体系。本专利技术在于发现HIV与CD-4蛋白的结合作用能在大肠杆菌中表达，并且发现这种HIV结合蛋白能够分泌到发酵培养基中。因此，具体地说，本专利技术就是指大肠杆菌表达载体，包括通过操作使HIV结合蛋白与调节单位相连接。本专利技术还发现HIV与CD-4蛋白的结合作用能在链霉菌中表达，并且发现这种HIV结合蛋白能够分泌到发酵培养基中。因此，具体地说，本专利技术系指链霉菌表达载体，包括通过操作使HIV结合蛋白与调节单位相连接。本专利技术还发现HIV与CD-4蛋白的结合作用能在酵母中表达。因此，具体地说，本专利技术系指酵母表达载体，包括通过操作使HIV结合蛋白与调节单位相连接。本专利技术还发现OMPA前导序列能够用于从大肠杆菌输出异源蛋白。因此，具体地说，本专利技术系指用于表达大肠杆菌中被输出蛋白的大肠杆菌表达载体，包括通过操作使DNA编码序列与调节单位相连接，其中DNA编码序列为蛋白X-Y编码，C代表OMPA前导序列，y代表异源蛋白。根据本专利技术，由CD-4受体衍生的HIV结合蛋白以可以使用的量用作治疗剂和/或预防药来抑制HIV的初感染和抑制以后的HIV宿主感染的细胞与细胞的传播、用作筛选HIV-淋巴细胞结合的抑制剂;用作CD-4+淋巴细胞功能的抑制剂;或如下所述的其它用途。所有蛋白质具有HIV与CD-4结合的功能。这类蛋白的最佳例子是sCD-4蛋白及其衍生物。sCD-4蛋白是缺失跨膜和CD-4细胞原生质结构区的CD-4的衍生物。介绍sCD-4蛋白的例子见于Deen、Traunecker、Fisher和Hussey(Nature，331∶76-88，1988)以及Smith(Science，238∶1704，1987)等人各自发表的论文。本文例举的sCD-4蛋白是由Deen等(见上述期刊第83页)报导的SKBsCD-4。下面给出了氨基酸和核苷酸序列。该序列系由Maddon等给出的由CD-4cDNA衍生的5′端未转译区和前导序列(Cell，42∶93，1985)。由CHO细胞表达和分泌的成熟SKBsCD-4的第一个氨基酸是由151-133bp编码的赖氨酸。跨膜区的缺失是由用HpaⅡ在1252bp上限制了CD-4cDNA并且连接了一个衔接物，该衔接物恢复了1253-1257bp并在C端的缬氨酸之后取代了转译终止密码子TAA。由Maddon等报导的成熟CD-4的前3个氨基酸是谷氨酰胺(本文用氨基酸(-)2表示)-甘氨酸(本文用氨基酸(-)1表示)-天冬酰胺(本文作为赖氨酸用氨基酸(+)1表示)。另外，下面所报告的序列与Maddon等所报告的序列相同。基本上保持着sCD-4的HIV结合亲和性的sCD-4截端及其衍生物也可按本专利技术表达。最好在这些截端中，蛋白质和多肽包括V1和V2两个区的HIV结合区，该结合区大致是在氨基酸1-182内。关于上述序列中，一个具体例子是本文称之为VIJ4的蛋白质，它具有与氨基酸351-369(-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸至-苏氨酸-脯氨酸-缬氨酸-C)融合的氨基酸(-)2-104(N-谷氨酰胺-甘氨酸-赖氨酸-至-丙氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-C)。第二个例子是本文称之为VIV2J4的蛋白质，它具有与氨基酸351-369融合的氨基酸(-)2-183(N-谷氨酰胺-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸-丝氨酸-C)。第三个例子是本文称之为YVI的蛋白质，它包括至-赖氨酸-氨基酸(-)9-151(N-丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-至-亮氨酸-谷氨酸-亮氨酸-C)。第四个例子是本文称之为SKBYsCD-4，它具有氨基酸(-)9-369。均以OKT4A结合为基础的这些HIV结合蛋白中，每一个HIV结合蛋白都具有HIV与sCD-4蛋白结合的特性，尤其是SKBsCD-4，更具体地说都具有HIV与sCD-4的V1和V2区结合的结构区，尤其是SKBsCD-4。除了本文中特别例举的这些蛋白外，本领域的专业人员能够很容易为其他sCD-4衍生物构建DNA编码序列。这些衍生物基本上仍保持着HIV与sCD-4蛋白的结合功能，也即蛋白与HIVenv蛋白gp120的结合没有明显的反作用。例如，专业人员能够构建仅仅具有V1区(约为氨基酸1-94)的衍生物，或构建仅仅具有CD-4的V1区的一部分。尤其是专业人员还能构建本文例举的蛋白质衍生物，例如由一个或少数氨基酸的缺失、增加或取代所形成的不同的衍生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备ＨＩＶ结合蛋白的方法，该方法包括培养由载体转化的大肠杆菌细胞和从中收集ＨＩＶ结合蛋白，所述载体含有ＨＩＶ结合蛋白的编码序列，通过操作与调节单位相连接。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯阿托斯，玛丽埃伦布劳纳，菲利普厄尼斯特克拉克，基思查尔斯迪安，詹姆斯艾伦福恩，沃尔德，杰西卡安尔戈曼，甘内什马胡苏丹沙菲，雷蒙惠特尼斯威特，迪安佩龙泰勒，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩贝克曼公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]