体内示踪细胞并用于体内测定细胞寿命的方法。细胞用花青类染料标记并通过测定荧光、吸光率或通过探测花青类染料中所包含的核磁共振探针来进行检测。例如，用本发明专利技术的方法，可测定红血细胞及血小板的寿命。还可示踪细胞以测定原发或转移肿瘤的位置，或隐蔽的感染部位。此外，用细胞通过血管的速率测定血管的升放及血小板凝聚。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体内示踪细胞的方法及测定体内细胞寿命的方法。体内细胞示踪及寿命测定需要用一个在细胞内稳定的标志来标记细胞，即，该标志不会从细胞中丢失也不显著地影响细胞功能。现有可用的标志不能提供这些必需的特性。例如，荧光抗体因其容易从细胞上解离而不适用。其它可能的标志因其干扰细胞功能而不能使用。花青染料已用于各种生物学用途。二氧羰花青染料已用来进行白细胞分类计数。Gunter Valet，Max Planck Ges Wissensch;专利登记号84-102307/17，《通过选择性染色及测量体积和荧光同时定量测定血细胞》。但在这些研究中用的染料是短链羰花青染料(少于10个碳)并对膜电位的变化起反应。而且，短链羰花青染料进入细胞的线粒体，是有细胞毒性的，并且当洗涤细胞时，不论细胞膜电位是否改变，这些染料都容易渗漏出细胞。在许多其它生物学试验中用其它短脂肪链花青染料。但短链分子会对膜电位起反应并穿过细胞膜，进入线粒体。H.M.Shapiro，美国专利号4，343，782，1982年8月10日。短链染料也对细胞有毒性而不能用于体内示踪细胞。三羰花青染料(Fox，I.J.，et al.，proc.Mayo Clinic，32478-484，1957)和伊文思蓝(Evans-Blue)染料(SChad，H.，et al.，Pfluegers Arch.Eur.J.Physiol.，370(2)139-144，1977)已通过释释法用于体内测定心输出量。Dow(Dow，P.，Physiol.Rev.，3677-102，1956)将此方法描述为，在肺的静脉侧注射已知量的某种血管内指示剂，测定该指示剂的动脉浓度的时间过程，以确定在注射和取样两点间的容量。这些染料不用来染色细胞。本专利技术是体内示踪细胞和测定体内细胞寿命的新方法。根据本专利技术的细胞示踪新方法，首先将细胞用花青类染料标记，然后将其注射给受试者，花青类染料用来确定细胞的位置。在另一个实施方案中，通过测量标记细胞消失的速率来确定细胞寿命。在本专利技术的体内示踪细胞及测定体内细胞寿命的方法中，用花青类染料标记细胞。在此，具有下列结构的化合物称为花青类染料 其中y是氧、硫、亚甲基或烷基取代的亚甲基;m是0-3;n是12-22。此处所用的烷基取代的亚甲基系指以任何组合的甲基、乙基或丙基取代的单或双取代的亚甲基。上述结构的化合物可用下列通用的速记式来表示DiYCn(2m+1)Sims，P.J.，et al.，Biochem，133315(1974)。这样，如该化合物中Y是硫，有三个碳连接两个环，并有两个十四碳的脂肪链，则表示为DiSC14(3)。类似地，DiIC14(5)表示该化合物中Y是异丙基，有五个碳连接两个环，并有两个十四碳的脂肪链。包括在此处称为花青类染料的化合物，是具有一个或多个取代的上述结构的化合物，假定这样的取代化合物至少在标记所需的时间内溶于细胞标记介质，并且有足够高的膜分配系数以保持与标记的细胞膜相连。这样的化合物还必须在标记所需的浓度下不显著影响细胞的活性。如下所述测定染料在细胞标记介质中的溶解度通过将花青类染料分散在标记介质中，用常规荧光分光光度技术测量荧光强度随时间的变化。荧光强度减弱表明染料沉淀并附着于容器壁上。例如，可用已知的流式细胞仪方法监测标记后注入供体动物的红血细胞的荧光强度，测定染料是否保持同细胞膜相连，注射后基本恒定的标记细胞的荧光强度，可证实染料在细胞膜中的稳定性。掺入一个可用磁共振成象技术检测的原子的上述结构的化合物，也包括在此处称为花青类染料的化合物中。这样的化合物可用已知技术制备，例如，把氟原子掺入脂肪链的一个甲基中。用一伽马放射体如125I标记的上述结构的化合物在此也归入花青类染料。本专利技术中所用的花青类染料可从各种来源如Molecular Probe，Inc.，Eugene，Oregon买到，也可用已知的合成方法从现有的起始物质制备。Hamer，F.M.，《花青染料和有关化合物》，Interscience Publishers(1964)。使用所专利技术的方法，任何活细胞都可用花青类染料标记。此处所用的术语细胞，包括有核的真核细胞如白血细胞、各种肿瘤细胞、其它哺乳动物细胞(如组织培养的中国仓鼠卵细胞)、酵母;无核的细胞如红血细胞和血小板。一个有核细胞如基本上能象对本类型的细胞所期望的那样生长或行使功能，那末就是活的;无核细胞如果能表现其预期的功能就是活的，如，一个活的红细胞能运输氧的二氧化碳;例如活的血小板在凝集和释放试验中象预期的那样表现出它的功能。细胞标记是在对细胞非致死的、能提供可重复的细胞标记的介质中进行。为使介质具有必备的特性，使用渗透性调节剂，至少在标记所需的时间内，花青染料在渗透性调节剂中形成稳定溶液。可用的渗透性调节剂包括象糖，单糖如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖，以及双糖如蔗糖，糖醇如甘露糖醇、甘油、肌醇、木糖醇、阿东糖醇、氨基酸如甘氨酸和精氨酸，还有某些顾氏缓冲剂(Good′s buffers)如N-三(羟甲基)-甲基-3-氨基丙磺酸。Good，N.E.，et al.，Biochem.15，467-477(1966)，Good，N.E.and S.Izawa，Methods Enzymol.，24，Part B，53(1968)，Feguson，W.J.，et al.，Anal.Biochem.104301-310(1980)。然而，某些细胞系可能对一种或多种渗透性调节剂敏感，特别是对糖醇。因此，在标记前要进行标准试验以确定细胞在所要用的渗透性调节剂中能存活。此外，可将少量缓冲剂加入标记介质以调节氢离子浓度。接触各种渗透性调节剂对细胞活性的影响，通过在细胞接触各种渗透性调节剂30分钟后测量Yac细胞的倍增时间来确定。Yac细胞是一种小鼠淋巴瘤组织培养细胞系，可从American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到，并在European Journal of Immunology 5112-117(1975)中作了描述。表1所示的数据表明，与用磷酸盐缓冲液相比，接触蔗糖、葡萄糖、顾氏缓冲剂(TAPS、CAPS、EPPS、HEPPSO、DIPSO)对细胞倍增时间没有影响，表明不存在与接触相关的细胞毒性。表1渗透性调节剂 倍增时间(小时)磷酸盐缓冲液 31.0蔗糖 41.0葡萄糖 34.5TAPS 32.7CAPS 45.8EPPS 32.2HEPPSO 23.4DIPSO 36.73-氨基-1-丙磺酸 99.63-(N-吗啉基)丙磺酸钠(MOPS) A2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇 B2-氨基-2-甲基-1-丙醇 BN-三(羟甲基)甲氨基乙磺酸(TES) BN，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES) A3-(环己氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO) A三乙醇胺 B三(羟甲基)氨基甲烷(TR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在受试者体内示踪细胞的方法，包括测定预先引入受试者体内的花青类染料标记细胞的位置。
【技术特征摘要】
US 1986-10-31 925,455的范围内进行修改的权利。权利要求1.一种在受试者体内示踪细胞的方法，包括测定预先引入受试者体内的花青类染料标记细胞的位置。2.一种根据权利要求1的方法，其中花青类染料标记的细胞是亲肿瘤细胞的，所以可检测原发或转移的肿瘤细胞。3.一种根据权利要求2的方法，其中花青类染料标记的细胞是淋巴细胞或自然杀伤细胞。4.一种根据权利要求3的方法，其中的淋巴细胞或自然杀伤细胞在引入受试者之前被激活。5.一种根据权利要求2的方法，其中亲肿瘤细胞的花青类染料标记的细胞是单核细胞。6.一种根据权利要求2的方法，其中亲肿瘤细胞是单核细胞，由于它与肿瘤特异的单克隆抗体相连所以保持了对肿瘤细胞的识别。7.一种根据权利要求2的方法，其中的亲肿瘤细胞的花青类染料标记的细胞是血小板。8.一种根据权利要求2的方法，其中的亲肿瘤细胞的花青类染料标记的细胞是中性白细胞。9.一种根据权利要求1的方法，其中的花青类染料是DiSC14(5)或DiOC14(3)。10.一种根据权利要求9的方法，其中的花青类染料用一个伽马放射体标记。11.一种根据权利要求9的方法，其中的花青类染料用一个核磁共振探针标记。12.一种根据权利要求1的方法，其中花青类染料标记的细胞特异地与感染受试者的感染原相互作用以确定感染部位。13.一种根据权利要求12的方法，其中的感染原是细菌或真菌。14.一种根据权利要求13的方法，其中的花青类染料标记的细胞是中性白细胞。15.一种根据权利要求1的方法，其中花青类染料标记的细胞是红血细胞。16.一种根据权利要求15的方法，其中，观察受试者的视网膜中花青类染料标记的红血细胞的存在，以检测视网膜病或者血管变性。17.一种根据权利要求15的方法，其中测量花青类染料标记的红血细胞在血管中的流动速率。18.一种根据权利要求15的方法，其中花青类染料的激发波长在人类可见光谱之外。19.一种根据权利要求1的方法，其中花青类染料标记的细胞是血小板。20.一种根据权利要求19的方法，其中，在视网膜血管中检测花青类染料标记的血小板的凝集。21.一种根据权利要求1的方法，其中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：保罗卡尔霍兰，休埃伦斯莱扎克，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩贝克曼公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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