一种DNA的细胞内示踪分析方法技术

本发明专利技术涉及一种DNA的细胞内示踪分析方法。本发明专利技术优化了一种DNA细胞内示踪的方法，选择到了多种显色标记来标记DNA、细胞核以及溶酶体，从而利用共定位的方法研究外源基因在细胞内的存在以及运动情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及一种DNA的细胞内示踪分析方法。
技术介绍
在生物
中，转基因技术是最为常用且必不可少的手段。但在进行外源基因的转染后，如何观察外源基因进入细胞的效率，以及外源基因在细胞内的存在或运动情况也是本领域需要关注的。通过PCR扩增以及电泳鉴定尽管能够鉴定外源基因是否转入， 但是其转入后在细胞内的存在情况却没有办法得知，也即无法在活体的情况下根据需要动态地观察外源基因在不同阶段在细胞中所处的位置和运动情况通过同位素、荧光素或染料来进行细胞标记也已经被本领域人员使用。然而，目前用于进行标记的染料有许多种，有些染料对于细胞有一定的毒性。有些染料之间存在串色现象，在多于一种染料同时应用时常常分辨率不高，观察效果并不理想。目前，对于非病毒基因输送体系的研发是分子治疗领域的热点，有效安全的基因输送载体将突破基因治疗的瓶颈给广大患者带来福音。在研究开发新型的非病毒载体的过程当中，确定非病毒载体在不同种类细胞内的限速步骤是一个很重要的挑战。在外源基因最终表达之前，有三个步骤最为关键①细胞内吞；②内吞溶酶体逃逸；③DNA入核。但目前尚无同时分别标记DNA、溶酶体、细胞核，利用共定位的方法研究外源基因在细胞内的运动的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种DNA的细胞内示踪分析方法。在本专利技术的第一方面，提供一种外源基因的细胞内示踪方法，所述方法包括(1)以Cy5荧光素标记外源基因(或携带外源基因的载体)，将经过标记的外源基因转入细胞内；(2)以染料Hochest标记细胞的细胞核；(3)以染料LysoiTracker Red DND-99标记细胞的溶酶体；和(4)以细胞中的蓝色标记的细胞核以及红色标记的溶酶体为参照，观察绿色荧光标记的外源基因在细胞内的分布或运动情况。在一个优选例中，所述的外源基因存在于质粒中。在另一优选例中，步骤⑵在步骤⑶之前；或步骤⑶在步骤⑵之前。在另一优选例中，所述的以Cy5荧光素标记外源基因的方法是将 Cy5 荧光素(较佳地为 Label IT Tracker Reagent Intracellular NucleicAcid Localization Kit_Cy 5)与外源基因共孵育后，加入NaCl和无水乙醇，静置、离心取沉淀，洗涤后收集沉淀，获得Cy5荧光素标记的外源基因。在另一优选例中，所述的以染料Hochest标记细胞的细胞核的方法是在细胞中加入染料Hochest (较佳地为Hoechst 33342)标记溶液(较佳地 2. O 士 0. 5 μ g/ml)，共孵育(较佳地孵育2-10分钟，更佳地孵育4_5分钟)，收集细胞并洗涤 (较佳地用HBSS清洗一遍)，获得细胞核标记染料Hochest的细胞。在另一优选例中，所述的以染料Lysol^racker Red DND-99标记细胞的溶酶体的方法是在细胞中加入LysoTracker Red DND-99标记溶液(较佳地100士20nM)，共孵育 (较佳地孵育0. 5-1. 5分钟，更佳地孵育1分钟)，收集细胞并洗涤(较佳地用HBSS清洗一遍)，获得溶酶体标记染料LysoTracker Red DND-99的细胞。在另一优选例中，将经过标记的外源基因转入细胞内采用的转染试剂是 PEI600-CyD^ PEI-25kDa Lipofectamine 2000 Reagent。在另一优选例中，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光标记的外源基因在细胞内的分布或运动情况。在另一优选例中，荧光素Cy5的激发光波长为649nm，发射光波长为670nm ；染料Hoechst的激发光波长为350nm，发射光波长为461nm ；或染料LysoTracker Red DND-99的激发光波长为577nm，发射光波长为590nm。在本专利技术的第二方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒用于对外源基因进行细胞内示踪，其中含有Cy5荧光素、染料Hochest和染料LysoiTracker RedDND-99。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有选自以下的一种或多种试剂标记缓冲液，灭菌水，氯化钠，乙醇，洗涤剂或转染试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有使用说明书。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1显示了利用荧光素标记方法示踪pEGFP转染4h后在BMSC细胞内的分布。 具体实施例方式本专利技术人经过深入的研究，优化了一种DNA细胞内示踪的方法，选择到了多种显色标记来标记DNA、细胞核以及溶酶体，从而利用共定位的方法研究外源基因在细胞内的存在以及运动情况。本专利技术人已经利用荧光素Cy5标记质粒，染料Hochest标记细胞内的细胞核，染料 LysoTracker Red DND_99dye标记细胞内的溶酶体。通过染色标记系统可在活体的情况下根据需要动态地观察外源基因在不同阶段在细胞中所处的位置和运动情况。借助该系统可以对外源基因在转染过程中的限速步骤进行较为全面的分析，并对改进载体特性提供可靠依据。该标记技术简单易行、稳定可靠。因此，本专利技术提供了一种外源基因的细胞内示踪方法，所述方法包括(1)以Cy5 荧光素标记外源基因或携带外源基因的载体，将经过标记的外源基因转入细胞内；(2)以染料Hochest标记细胞的细胞核；(3)以染料LysoTracker RedDND-99标记细胞的溶酶体；和以细胞中的蓝色标记的细胞核以及红色标记的溶酶体为参照，观察绿色荧光标记的外源基因在细胞内的分布或运动情况。本专利技术选用的试剂均可以在活体情况下对细胞进行显微镜下的观察，对细胞没有任何损伤。如果配合连续荧光显微镜照相系统，可以观察整个DNA转染细胞过程中，外源基因如何进入细胞膜和细胞核的过程，这对研究分析外源基因在细胞内的限速步骤具有十分重要的意义。由于需要同时标记三种不同的物质外源基因，溶酶体和细胞核。这就需要选择合适的、互补干扰的染料，以避免不同染料间发生“串色”现象而影响试验的可信度。本专利技术人经过合理的选择和反复地验证，发现三种染料Hochest，LysoTracker Red DND-99 dye, Cy5之间并无“串色”现象。对于外源基因的标记方法有很多种，本人以前曾经尝试过用量子点对质粒进行标记，发现该种方法比较繁琐，而且需要后续的其它试验对标记的情况进行分析和确认之后， 方可用于示踪分析。而本专利技术的方法对外源基因的标记采用的方法较为简便，无需多余的分析确认即可直接用于示踪分析，而且经过多次试验发现系统相对稳定。对于溶酶体和细胞核的标记方法，同样也比较方便易行。如本文所用，所述的“外源基因”也称为“外源DNA”，其也广义地包括携带有外源基因的质粒(载体)。作为本专利技术的优选方式，所述的以Cy5荧光素标记外源基因的方法是将Label IT Tracker Reagent Intracellular Nucleic Acid Localization Kit-Cy 5 与夕卜源基因共孵育后，加入NaCl和无水乙醇，静置、离心取沉淀，洗涤后收集沉淀，获得Cy5荧光素标记的外源基因。作为本专利技术的优选方式，所述的以染料Hochest标记细胞的细胞核的方法是在细胞中加入Hoechst 33342标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓玲，童海骏，戴尅戎，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：