突变的苏云金芽孢杆菌内毒素蛋白，表现出野生型δ－内毒素具有的杀虫活性特征。表明在每个单突变点上，可用编码其他任何天然氨基酸的密码进行置换以产生活性内毒素蛋白。还描述了编码这种内毒素的ＤＮＡ顺序及生产具杀虫活性的突变内毒素的重组技术。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)是一种能产生孢子的细菌，它在无性生长阶段的末期产生一种蛋白晶体δ-内毒素。此内毒素由某些昆虫吞食后产生毒性效应，包括停止进食、胃肠功能失常、脱水并最终导致死亡。δ-内毒素通常是由一质粒来源产生的一种无活性的前体或前毒素，分子量为130，000-140，000道尔顿(Calabrese，Canad，J.Microbiol.26∶1006，1980)。此分子在昆虫肠道内，通常由于肠道蛋白酶的水解作用而被切除掉C-端的大约一半，可能还切掉N-端的若干氨基酸，而这正是产生分子量为65，000-70，000道尔顿的活性毒素所必须的(Tyrell等，J.Bacteriol.145∶1052，1981)。已经鉴定了苏云金芽孢杆菌的大量亚种。虽然其中的大部分对于鳞翅目昆虫具有更大的特异性或增强的毒性，但也有一部分表现出对于其他类昆虫的毒性。例如，苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.t.israelensis)具有针对双翅目幼虫(蚊子和墨蚊)的毒性，最近还证明，另外两个亚种具有针对鞘翅目幼虫的毒性(Hofte等，Nuc.Acid.Res.15(17)7183，1987)。虽然已做了大量工作以生产活性毒素及其结构基团，但对于苏云金芽孢杆菌δ-内毒素顺序中的活性或毒性部分抵抗点突变的能力，以及这种突变对于毒素分子活性的影响，人们了解得似乎比较少。本专利技术的目的之一是在苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的活性部分提供新的突变种。本专利技术的进一步的目的是产生这样的突变它们能有效地使截断的和完整长度的δ-内毒素两种形式都产生类似苏云金芽孢杆菌内毒素的活性。本专利技术的另一目的是提供能增强苏云金芽孢杆菌δ-内毒素杀虫活性的突变。根据本专利技术，我们使成百上千的DNA链随机产生了单个和多个点突变，这些DNA链编码典型的具有鳞翅目杀虫活性的苏云金芽孢子杆菌内毒素活性部分的一大段，然后通过重组技术分离并产生了若干突变的苏云金芽孢杆菌内毒素，它们表现出野生型苏云金芽孢杆菌δ-内毒素所具有的针对鳞翅目的杀虫活性特征。而且还表明，在这些被发现的突变点处，能够置换编码任何其他天然氨基酸的密码以产生活性内毒素蛋白。还发现一些随机突变产生更强的杀虫活性。这种活性可以根据后面所述的方法加以证明，例如美洲菸夜蛾(Heliothisvirescens)检测法或粉蚊夜蛾(Trichoplusiani)检测法，在许多情况下，这种增强非常显著，其活性比母体内毒素结构至少高出两倍或更多倍。还分别对多突变(每条突变的DNA链通常2或3个氨基酸)单独及以不同组合进行了评价，以鉴别出那些更有效的突变及其组合。除了一个例子以外，还发现本专利技术的突变都存在于在大量野生型苏云金芽孢杆菌δ-内毒素中高度保守的氨基酸顺序内，因此表明是本专利技术提供的突变作用具有广泛的适用性，它能用于大量在这种保守区域内提供了具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌内毒素的内毒素结构。更具体地说，参考表A的氨基酸顺序及其编号(见后面，始于1位的甲硫氨酸(MET)，它也是表A所示的具有代表性的鳞翅目活性内毒素的正常N-端)，发现苏云金芽孢杆菌内毒素蛋白如果在其活性部分含有与表A所示的116个氨基酸残基顺序(90-205位，包括两头，也就是m-1至m-116位氨基酸)相同或基本同源的氨基酸残基顺序，则它们虽然具有如天然苏云金芽孢杆菌内毒素那样的针对鳞翅目昆虫的杀虫活性，但它们可在指出的或等同的同源位置具有下述一个或多个氨基酸残基(括号内的m位号码是针对所述的116氨基酸残基顺序而言)a)在94位(所述116氨基酸顺序的m-5位)，由遗传密码编码的除Asn外的任何天然氨基酸;b)在95位(所述116氨基酸顺序的m-6位)，除了Gln外的任何这种天然氨基酸;c)在101位(所述116氨基酸顺序的m-12位)，除Glu外的任何这种天然氨基酸;d)在105位(所述116氨基酸顺序的m-16位)，除Asn外的任何这种天然氨基酸;e)在116位(所述116残基顺序的m-27位)，除Glu外的任何这种天然氨基酸;f)在119位(所述116残基顺序的m-30位)，除Ala外的任何这种天然氨基酸;g)在122位(所述116残基顺序的m-33位)，除Thr外的任何这种天然氨基酸;h┰ 23位(所述116残基顺序的m-34位)，除Asn外的任何这种天然氨基酸;i)在125位(所述116残基顺序的m-36位)，除Ala外的任何这种天然氨基酸;j)在130位(所述116残基顺序的m-41位)，除Met外的任何这种天然氨基酸;k)在184位(所述116残基顺序的m-95位)，除Phe外的任何这种天然氨基酸;l)在187位(所述116残基顺序的m-98位)，除Ala外的任何这种天然氨基酸;m)在188位(所述116残基顺序的m-99位)，除Thr外的任何这种天然氨基酸;n)在194位(所述116残基顺序的m-105位)，除Asn外的任何这种天然氨基酸;以及o)在201位(所述116残基顺序的m-112位)，除Gly外的任何这种天然氨基酸。此外，同样参考表A所示的氨基酸残基顺序的号码，本专利技术还包括将第4位的氨基酸Asn变成由遗传密码编码的任何其他的天然氨基酸。对于在所述的116残基顺序中本专利技术提供的氨基酸残基来说，根据本专利技术，优选在所指出的位置具有下述一个或多个氨基酸的顺序(同样参考表A所示的完整的成熟顺序，还参考这种116残基顺序)a)94位是Lys(116残基顺序的5位);b)95位是Lys(116残基顺序的6位);c)101位是Lys(116残基顺序的12位);d)105位是Tyr(116残基顺序的16位);e)116位是Lys或Arg，更优选Arg(所述116残基顺序的27位);f)119位是Thr(所述116残基顺序的30位);g)122位是Ile(所述116残基顺序的33位);h)123位是Tyr(所述116残基顺序的34位);i)125位是Val(所述116残基顺序的36位);j)130位是Ile(所述116残基顺序的41位);k)184位是Ile(所述116残基顺序的95位);l)187位是Thr(所述116残基顺序的98位);m)188位是Ser(所述116残基顺序的99位);n)194位是Lys(所述116残基顺序的105位);以及o)201位是Asp(所述116残基顺序的112位)。如果要改变第4位氨基酸Asn，优选将它变成Tyr。表A靠近本说明书的末尾，它给出了与苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的天然生产有关的核苷酸顺序及因此推测出的氨基酸顺序。除了一个例外以外，此核苷酸顺序是得自苏云金芽孢杆菌武汉亚种(B.t.wuhanensis)中产生δ-内毒素的质粒。具体地说，完整的结构基因(实际编码内毒素本身)是来自苏云金芽孢杆菌武汉亚种，一个例外是在结构基因开始处的甲硫氨酸(Met)之前的顺序是来自苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种(B.t.kurstaki)HD-1中的产生内毒素的基因(HD-1的所谓5.3kbHindⅢ类质粒)，此上游顺序含有来自苏云金芽孢杆菌库斯塔亚种HD-1中产生内毒素质粒的天然的核糖体结合位上(RBS)。苏云金芽孢杆菌武汉亚种中含有核糖体结合位点的上游顺序与表A所示库斯塔亚种本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产具有昆虫毒性的内毒素蛋白的方法。该方法包括用一含有ＤＮＡ顺序的表达载体转化或转染细胞，此ＤＮＡ顺序包括编码与表Ａ中ｍ－１位至ｍ－１１６位的１１６氨基酸顺序基本同源的氨基酸顺序的部分，所述的应用于这种同源顺序的位置号码不受任何缺失或增加的影响，其中，所述ＤＮＡ进行了这样的修饰：在所指出的氨基酸参考位置处编码了下列任一个或多个氨基酸：ａ）ｍ－５，位，除Ａｓｎ外的任何天然氨基酸；ｂ）ｍ－６，位，除Ｇｌｎ外的任何天然氨基酸，ｃ）ｍ－１２，位，除Ｇｌｕ外的任何天然氨 基酸；ｄ）ｍ－１６，位，除Ａｓｎ外的任何天然氨基酸；ｅ）ｍ－２７，位，除Ｇｌｕ外的任何天然氨基酸；ｆ）ｍ－３０，位，除Ａｌａ外的任何天然氨基酸；ｇ）ｍ－３３，位，除Ｔｈｒ外的任何天然氨基酸；ｈ）ｍ－３４，位，除Ａｓｎ外的 任何天然氨基酸；ｉ）ｍ－３６，位，除Ａｌａ外的任何天然氨基酸；ｊ）ｍ－４１，位，除Ｍｅｔ外的任何天然氨基酸；ｋ）ｍ－９５，位，除Ｐｈｅ外的任何天然氨基酸；ｌ）ｍ－９８，位，除Ａｌａ外的任何天然氨基酸；ｍ）ｍ－９９，位，除 Ｔｈｒ外的任何天然氨基酸；ｎ）ｍ－１０５，位，除Ａｓｎ外的任何天然氨基酸；ｏ）ｍ－１１２，位，除Ｇｌｙ外的任何天然氨基酸；所述ＤＮＡ顺序在导致ＤＮＡ表达的调控之下，培养所产生的细胞以生产所述内毒素。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：辛迪卢杰利斯，詹姆斯罗伯特鲁希，丹利尔帕克韦特，
申请(专利权)人：山道士有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。