有机化合物的改进制造技术

通过克隆编码木质素酶脱辅基蛋白的Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ的ＤＮＡ顺序，获得重组木质素酶，在适宜的宿主细胞中表达重组脱辅基蛋白，以及用血红素重建重组木质素酶蛋白。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及木质素改性和降解酶。木质素是由取代肉桂醇前体经自由基的聚合作用生成的复合聚合物，含有15～35%(重量)干木材。浆化处理时，必须从包有木质素基质中将纤维素离解出来，使他们能互相结合，得到具有强度的最终产物。这种聚合物的分离，可以采用化学浆化方法去除木质素，或采用高得率的机械浆化方法保持木质素。漂白处理时，去除木质素，得到发亮的浆料。木质素对生物腐蚀具有很高的抗性，业已证明，任何有机体都不能以木质素作为唯一碳源进行生长。但是，这种复杂的木质素聚合物通过各种高级真菌的纯培养物可以完全降解。对白蚀菌(white-rot fungi)的木质素生物降解作用进行的最广泛的生理研究证明，使用Corticra-ceae族系的Phanerochaete Chrysosporium Burds能够对木质素进行充分的降解。在一定的实验室条件下，大约培养3天的时间，还观察不到真菌对木质素的降解作用。接着，培养菌对碳或氮产生饥饿现象，培养4或5天至多6天，开始观察到木质素的降解。根据对碳氮的饥饿诱导木质素降解，说明真菌的木质素代谢属于一种次级代谢性质。目前真菌的木质素降解由于若干原因还不能实现工业化。由于诱导降解木质素的效率仅仅是作为次级代谢的结果，所以木质素降解的速度慢得令人难以接受。为此，要求继饥饿之后即开始生长时期。此外，真菌把纤维素作为其主要营养来源，导致浆料产量降低和浆料制品质量低劣。世界专利文件WO 87/00550号介绍了名为rLDMTM6的木质素降解酶制剂，它是由P.Chrysosprium衍生得到的(rLDMTM6是由麻省坎布里奇Repligen公司制造的木质素降解和改性酶的商品牌号)。这种酶制剂基本上是纯化的，因此基本上也不含其他rLDMTM，它是一种天然的降解蛋白酶。这种酶含有与血红素单位相结合的蛋白质成分(脱辅基蛋白)，该血红素单位等同于以氧化形式(Fe+3)存在的正铁血红素Ⅸ。这种rLDMTM6制剂具有适用于木材制浆和污水处理的理想性质。rLDMTM显示有过氧化物酶的活性，其重要性质的特征在于，在有过氧化氢存在的条件下，能将藜芦基醇催化氧化为藜芦基醛。关于rLDMTM的物理参数公诸如下(1)用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶泳(SDS-PAGE)测定的分子量;(2)氨基酸组分;(3)血红素含量;(4)与抗体反应速度的等同性;(5)对木质素模拟底物作用的特异性;(6)按规定的乙酸钠体积摩尔浓度洗脱FPLC层析柱。尽管可按WO87/00550号专利文件所述方法制备rLDMTM6，但是如果能够克隆编码rLDMTM6蛋白的DNA异在适宜的宿主中表达，则用遗传工程方法可期望更有效地实现是rLDMTM6的制备。然而由于P.Chrysosporium基因的活性在异种宿主中的表达，以前从未取得成功，并且现有技术也从未提供过如何成功地进行这种克降和表达，所以对此能否获得成功还很难预料。本专利技术通过克隆编码木质素酶蛋白的DNA顺序及其在适宜宿主细胞中的表达和用正铁血红素Ⅸ重建重组木质素酶蛋白，提供重组rLDMTM6木质素酶。于是，本专利技术提供源于天然P.Chrysosporium的编码rLDMTM6蛋白的DNA顺序，其顺序示于表1。从DNA顺序中推导得到的蛋白质的氨基酸顺序示于同一表中。为rLDMTM6蛋白编码的DNA顺序的克隆开始于从Phanerochaete chrysosporium的发酵中制备足够量的RNA。大量RNA是从名为SC26，NRRL 15978的ATCC24725的紫外线诱导突变体制备的。在用逆转录酶复制mDNA后，基因库包括为次级代谢中的基因编码的DNA顺序，该次级代谢包括木质素改酶或木质素降解酶的构建。对rLDMTM6的抗体反应用来检验基因库。对交叉反应克隆进行检测。用常规方法，从克隆的分离物中制备噬菌体DNA。然后将该DNA插入到以后将rLDMTM6蛋白表达于反应潜能宿主的适宜载体中。各种改性重组rLDMTM6蛋白，凡在用血红素重建时能基本上具有与rLDMTM6相同酶活性的，都包括在本专利技术的范围内。由于从其他天然等位基因所表达的rLDMTM蛋白存在的可能性极大，所以结构修饰既可用已知方法构建，也可采用天然来源。用遗传工程修饰的rLDMTM6蛋白还证明，当用血红素重建时，能具有木质素酶活性。例如，含有由一个或多个氨基酸在正常的氨基末端延长的完全rLDMTM6顺序的蛋白质已按下述方法产生。含有由另外的氨基酸在正常的C末端延长的该完全顺序也可按本文所述方法，通过表达质粒在琥珀型宿主中的表达产生。在rLDMTM6修饰蛋白的定义范围内，还有从DNA顺序所表达的原初蛋白的亚片段，该顺序与所揭示的原初rLDMTM6蛋白的DNA顺序杂交。在用血红素重建时，原重组rLDMTM6蛋白或rLDMTM6修饰蛋白可按与天然酶相同方法，用于降解或改性木质素;并且对纸浆木质素有作用，如对未漂白牛皮纸浆;对磨制木质素如机制浆料，以及对本质素模拟化合物都有作用。rLDMTM6蛋白的基因也可用作为操查物的rLDMTM6蛋白的cDNA中的部分顺序，从基因组DNA即所谓的基因组克隆中分离得到。在本领域中该项技术是众所周知的，参阅Maniates，T，Fritsch，E.F.和Sambsock，J.，《分子克隆实验室手册》(冷泉港实验验室，NY，1982年。由此得到的基因组克隆可插入到各种宿主的适宜载体中。重建时，除了表1所列DNA顺序外，修饰DNA顺序包括天然等位基因和用遗传工程方法修饰的并能为具有rLDMTM6酶活性的rLDMTM6蛋白编码的DNA顺序，这些顺序也都属于本专利技术范围。在为rLDMTM6蛋白编码的DNA顺序中，可得到以一个或多个饰变的等位基因，例如从天然有机体中经过探查后得到，即由P.Chsysosporium或类似木材降解菌衍生合适的cDNA或基因组DNA库，它们具有从为rLDMTM6完全顺序编码的DNA中切割得到的一个或多个适宜长度的标记DNA，至少含有大约20至300个核苷酸，这些方法在本文中已有介绍。上述为修饰蛋白编码的修饰顺序也可以按本文所述，采用已经建立的技术直接由为rLDMTM6蛋白编码的cDNA或基因组DNA顺序得到，例如采用位点的特殊诱变、环出方法和其他取代核苷酸的已知方法。关于rLDMTM6原蛋白和rLDMTM6修饰蛋白的核苷酸顺序，熟悉本领域的专业人员很容易理解，这是与为rLDMTM6蛋白编码的其他相当的核苷酸顺序相一致的。正如人们所知，不同的核苷酸顺序能够为同一个蛋白质编码，这是因为有多余的遗传密码，即大多数氨基酸都可由多个核苷酸三联(密码子)编码。因此，本专利技术的范围不仅包括本文所述的特殊核苷酸顺序，而且还包括在用血红素重建时，为基本上具有相同rLDMTM6木质素酶活性的分子编码的所有相应的核苷酸顺序。基于本文公开了为rLDMTM6蛋白编码的核苷酸顺序，所以该顺序可用本领域已知方法通过“基因装配”合成。因此，就本专利技术的广义而言，按本专利技术提供的核苷酸顺序包括为具有木质素酶活性的蛋白质编码，以及与为表1所列的rLDMTM6完全蛋白编码的顺序在约束杂交条件下(例如60℃，在2.5×柠檬酸盐缓冲液中)进行杂交的那些cDNA和/或基因组DNA顺序。然而，正如人们可以理解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种木质素酶蛋白的分离重组体或合成ＤＮＡ的编码顺序。

【技术特征摘要】
CH 1987-5-11 048,202;US 1986-9-12 906,8531.一种木质素酶蛋白的分离重组体或合成DNA的编码顺序。2.用于木质素酶蛋白的DNA密码，包括下列氨基酸顺序。10ALA THR CYS SER ASN GLY LYS THR VAL GLY ASP ALA20SER CYS CYS ALA TRP PHE ASP VAL LEU ASP ASP ILE GLN GLN30 40ASN LEU PHE HIS GLY GLY GLN CYS GLY ALA GLU ALA HIS GLU50SER ILE ARG LEU VAL PHE HIS ASP SER ILE ALA ILE SER PRO60ALA MET GLU ALA GLN GLY LYS PHE GLY GLY GLY GLY ALA ASP70 80GLY SER ILE MET ILE PHE ASP ASP ILE GLU THR ALA PHE HIS90PRO ASN ILE GLY LEU ASP GLU ILE VAL LYS LEU GLN LYS PRO100 110PHE VAL GLN LYS HIS GLY VAL THR PRO GLY ASP PHE ILE ALA120PHE ALA GLY ALA VAL ALA LEU SER ASN CYS PRO GLY ALA PRO130GLN MET ASN PHE PHE THR GLY ARG ALA PRO ALA THR GLN PRO140 150ALA PRO ASP GLY LEU VAL PRO GLU PRO PHE HIS THR VAL ASP160GLN ILE ILE ASN ARG VAL ASN ASP ALA GLY GLU PHE ASP GLU170 180LEU GLU LEU VAL TRP MET LEU SER ALA HIS SER VAL ALA ALA190VAL ASN ASP VAL ASP PRO THR VAL GLN GLY LEU PRO PHE ASP200SER THR PRO GLY ILE PHE ASP SER GLN PHE PHE VAL GLU THR210 220GLN LEU ARG GLY THR ALA PHE PRO GLY SER GLY GLY ASN GLN230GLY GLU VAL GLU SER PRO LEU PRO GLY GLU ILE ARG ILE GLN240 250SER ASP HIS THR ILE ALA ARG ASP SER ARG THR ALA CYS GLU260TRP GLN SER PHE VAL ASN ASN GLN SER LYS LEU VAL ASP ASP270PHE GLN PHE ILE PHE LEU ALA LEU THR GLN LEU GLY GLN ASP280 290PRO ASN ALA MET THR ASP CYS SER ASP VAL ILE PRO GLN SER300LYS PRO ILE PRO GLY ASN LEU PRO PHE SER PHE PHE PRO ALA310 320GLY LYS THR ILE LYS ASP VAL GLU GLN ALA CYS ALA GLU THR330PRO PHE PRO THR LEU THR THR LEU PRO GLY PRO GLU THR SER340 344VAL GLN ARG ILE PRO PRO PRO PRO GLY ALA.3.用于木质素酶蛋白的DNA密码，包括下列氨基酸顺序10ALA THR CYS SER ASN GLY LYS THR VAL GLY ASP ALA20SER CYS CYS ALA TRP PHE ASP VAL LEU ASP ASP ILE GLN GLN30 40ASN LEU PHE HIS GLY GLY GLN CYS GLY ALA GLU ALA HIS GLU50SER ILE ARG LEU VAL PHE HIS ASP SER ILE ALA ILE SER PRO60ALA MET GLU ALA GLN GLY LYS PHE GLY GLY GLY GLY ALA ASP70 80GLY SER ILE MET ILE PHE ASP ASP ILE GLU THR ALA PHE HIS90PRO ASN ILE GLY LEU ASP GLU ILE VAL LYS LEU GLN LYS PRO100 110PHE VAL GLN LYS HIS GLY VAL THR PRO GLY ASP PHE ILE ALA120PHE ALA GLY ALA VAL ALA LEU SER ASN CYS PRO GLY ALA PRO130GLN MET ASN PHE PHE THR GLY ARG ALA PRO ALA THR GLN PRO140 150ALA PRO ASP GLY LEU VAL PRO GLU PRO PHE HIS THR VAL ASP160GLN ILE ILE ASN ARG VAL ASN ASP ALA GLY GLU PHE ASP GLU170 180LEU GLU LEU VAL TRP MET LEU SER ALA HIS SER VAL ALA ALA190VAL ASN ASP VAL ASP PRO THR VAL GLN GLY LEU PRO PHE ASP200SER THR PRO GLY ILE PHE ASP SER GLN PHE PHE VAL GLU THR210 220GLN LEU ARG GLY THR ALA PHE PRO GLY SER GLY GLY ASN GLN230GLY GLU VAL GLU SER PRO LEU PRO GLY GLU ILE ARG ILE GLN240 250SER ASP HIS THR ILE ALA ARG ASP SER ARG THR ALA CYS GLU260TRP GLN SER PHE VAL ASN ASN GLN SER LYS LEU VAL ASP ASP270PHE GLN PHE ILE PHE LEU ALA LEU THR GLN LEU GLY GLN ASP280 290PRO ASN ALA MET THR ASP CYS SER ASP VAL ILE PRO GLN SERLYS PRO ILE PRO GLY ASN LEU PRO PHE SER PHE PHE PRO ALA310 320GLY LYS THR ILE LYS ASP VAL GLU GLN ALA CYS ALA GLU THR330PRO PHE PRO THR LEU THR THR LEU PRO GLY PRO GLU THR SER340VAL GLN ARG ILE PRO PRO PRO PRO GLY ALA＊＊＊MET ILE PRO350TYR ARG ILE ARG LEU GLU PRO THR VAL THR VAL ALA GLY.4.根据权利要求2或3的DNA顺序，其中用于蛋氨酸的ATG密码在用于丙氨酸的氨基末端密码之前。5.根据上述权利要求之任一项的DNA顺序，系天然来源的基因组DNA顺序。6.一种与权利要求2、3和4限定的DNA在约束杂交条件下进行杂交的DNA密码顺序。7.根据上述权利要求之任一项的DNA顺序，其5′端与信号顺序可经操作连接。8.根据上述权利要求之任一项的DNA顺序，与用于原核宿主和/或真核宿主中表达的控制顺序可经操作连接。9.一种含有并能表达权利要求1至8中任一项限定的DNA顺序的转移载体。10.一种选自pBSR，pLn104，pLn105，pLn106和pLn1001的质粒。11.用权利要求1至8之任一项限定的DNA顺序转化的重组宿主细胞。12.一种产生木质素酶蛋白的方法，其中包括培养权利要求11的转化细胞。13.一种按权利要求12的方法得到的重组木质素酶蛋白。14.一种未糖基化的木质素酶蛋白，包括下列氨基酸顺序ALA THR CY...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特L法雷尔，保罗吉利普，阿尔吉斯安尼里昂尼斯，卡沙雅贾瓦哈利安，西奥多E梅昂，姆斯斯R鲁希，布鲁斯A萨多尼克，詹尼弗A杰克逊，
申请(专利权)人：山道士有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]