新颖的微生物制造技术

本发明专利技术提供了新颖的微生物－它们含有苏云金菌柯氏变种δ－内毒素编码的基因和嗜暗变种δ－内毒素的编码基因，并提供了它们的制备方法及含有这种微生物的杀虫剂组分和应用．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurimgiensis，下文称B.T)杂交菌株、它们的制备、含有杂交菌株的杀虫剂成分以及它们的使用。更明确地说，本专利技术涉及带有苏云金菌柯氏变种(B.T.Kurs-taki)δ-内毒素编码基因的一种质粒和苏云金菌嗜暗变种(B.T.tenebrionis)δ-内毒素编码基因的一种质粒的杂交细菌细胞;通过产生内毒素晶体的柯氏变种和产生内毒素晶体的嗜暗变种之间的接合作用而获得这种杂交株，并且杂交株还能够产生柯氏变种和嗜暗变种各自典型的δ-内毒素晶体。柯氏变种的δ-内毒素晶体具有特有的双锥形，而嗜暗变种晶体典型的平行六面体(或正方体)外形。本专利技术的B.T杂交菌株可以对其亲代菌株柯氏变种和嗜暗变种所控制的害虫进行生物防治。以常规方式通过产生δ-内毒素的柯氏变种和产生δ-内毒素的嗜暗变种的接合，以及用完全知道的分离技术分离杂交株，来获得本专利技术的B.T.杂菌菌株。接合技术在遗传工程领域内也已有很好的了解(如见Gonzatez J.M.and Carlton B.C.，1982.Plasmid transfer in Bacillus thuringiensis，85-95.in Genetic and Cellular Technology一书，L.P.Gape编Genetic Exchange vol.1.U.N.Streips等编，Marcel Dekker，Inc.New York and Basel)。常规来说，接合作用是由接合质粒传递的。这种接合质粒的一个合适例子是从粪链球菌(Streptococcus faecalis)得到的pAMβ1，一般称为β-质粒。然后这质粒用已知技术(例如由H.-M.Fisher专利技术的技术，1983，Plasmid und Plasmidübertragung bei Bacillus thuringiensis.博士论文ETH Nr.7375，Swiss Federal Institute of Technology，ADAG Administration and Druck AG.共83页。或按照上述的Gonzalez等一文)引入到B.T.菌株内。这样获得的含有β-质粒的B.T菌株在柯氏变种和嗜暗变种菌株之间的接合反应中作为给体株。为了有利于接合体(如本专利技术的杂交菌株)的检测和分离，给体菌株和受体菌株都作了遗传标记。这些标记能以完全了解的方式被引入菌内。例如已经知道在格蓝氏阴性细菌中，β-质粒给以抗红霉素。这一特性能用来消除接合反应后不具有此特性的所有菌株。当另外的接合反应的匹配株也作标记时，例如经过诱导或自发对四环素等某个抗菌素有抗性，通过把这微生物培养在含有红霉素和四环素的适当培养基上，将有可能除去那些不带这两种遗传标记的所有菌株(即所有非接合菌株)。唯有在这种培养基上能生长的微生物将是携带两种标记(即抗红霉素和四环素)的菌株。然后可以以完全已知的方式，如通过肉眼鉴定含有B.T.柯氏变种和嗜暗变种两种晶体类型的菌落或者文献中已知的生物学/生物化学技术，实现最终分离本专利技术的B.T.杂交株。制备本专利技术杂交株的一个方便步骤是柯氏变种用嗜暗变种进行接合反应，其中给体菌株含有接合质粒，给体和受体菌株都带有适当的遗传选择标记。一般来说，在本专利技术的接合反应过程中更倾向于用柯氏变种作为给体。接合反应一般是在含有氮源、碳水化合物和生长因子的培养基中，20-40℃范围的某一温度下适当地进行的。起始材料可以常规方式得到，从已知的柯氏变种和嗜暗变种开始。对液体培养基来说，通常给以通气或振荡，因此培养时间一般为4至96小时。在下面非限定的接合反应实例中，含β-质粒的柯氏变种用作给体，该质粒作为接合质粒，具有红霉素抗性。受体嗜暗变种是自发的四环素抗性实变株。温度以摄氏表示。份数以重量表示。实例1接合反应含有粪链球菌接合片段pAMβ1的柯氏变种HD-73(NRRL B-4488)培养物2.5毫升和嗜暗变种(Deutsch Sammlung für Microorgamismen DSM 2803)一株四环素抗性的自发突变体的培养物2.5毫升，每一培养物都处于对数生长期(约5×107细胞/毫升)、混合。在醋酸纤维素滤膜(O×oid/Nuflow)(0.45微米，25毫米直径)上过滤。过滤物在Lurla培养基(LA)平板上(1升Luria培养液含有15克琼脂、10克酪蛋白、5克醇母浸出物、10克NaCl、0.02克胸苷)，在37℃培养16-24小时。过滤物悬浮在0.5毫升液体LA(没有琼脂)中，用力摇匀，它的10°和10-1稀释度加在含有50微克/毫升红霉素和5微克/毫升四环素的LA平板上，选择接合体。这样获得的红霉素和四环素抗性接合体放在允许产生芽孢的培养基上，用显微镜检查δ-内霉素的存在和性质。在杂交株里，裂介之前孢子除了有嗜暗变种典型的平行六面体(立方体)晶体之外，还含有柯氏变种特有的双锥形晶体。这些晶体的大小约2微米，在相差显微镜下很容易看见。杂交株照例用肉眼鉴定很容易分离。杂交株的菌落(在LA平板上30℃培养16小时后)具有与嗜暗变种相同的菌落形态，而很容易与柯氏变种的菌落区分开。嗜暗变种菌落 或杂交株 柯氏变种形状 不规则 圆形高度 凸起 凸面边缘 波纹形 完整表面 粗糙 光滑琼脂糖凝胶电泳分析从杂交种提取的DNA。也可以具体地证明质粒从给体株导入到了受体株内。质粒DNA分子经溴化乙啶染色后用紫外光照射可以观察到，并照相(见Lereclus D.Menou Gand Lecadet M-M.，1983，Mol.Gen.Genet.191，307-313)。尤其本专利技术的大多数杂交株具有受体株嗜暗变种的典型的10兆道尔顿(Md)的质粒，给体菌柯氏变种具有5.6Md的质粒。携带柯氏变种和嗜暗变种的δ-内毒素编码基因的质粒有大致相同的分子量，因而不容易在杂交株的质粒图谱(plasmadogram)中区分开来。本专利技术的B.T.杂交株具有杀昆虫的有用特性。它们对易受柯氏变种以及嗜暗变种感染的害虫都具有活性。一般来说，在活性的水平上或活性的范围，或者两方面，杂交种的杀虫性能都超过接合亲本菌株简单混合所能观察到的性能。本专利技术B.T杂交选择到的菌株具有十分令人惊奇的杀虫性能，在下面生物测定中描述了它们对粉纹夜蛾Trichoplusia ni(苷兰菜的尺蠖虫)、海灰翅夜蛾Spodoptera Litteralis(埃及棉叶虫)和辣根猿叶甲Phaedon cochleariae(芥菜甲虫)等昆虫幼虫的活性。生物测定108孢子/毫升的水悬浮液用微型喷枪喷洒到中国甘兰的叶子上，直到液珠掉下来的程度。当喷洒液干燥时，每张叶子都摊在直径9厘米的塑料培养皿中潮湿滤纸上，每皿放进10个昆虫(处于二龄期的幼虫)。每种昆虫各用三个培养皿。测定在25℃的气候小室中进行，相对本文档来自技高网...

【技术保护点】
杂交株的苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ－ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ－ｎｓｉｓ）细胞，含有给体Ｂ．Ｔ．柯氏变种δ－内毒素编码的基因和嗜暗变种δ－内毒素编码的基因。

【技术特征摘要】
GB 1985-10-30 85267741.杂交株的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringie nsis)细胞，含有给体B.T.柯氏变种δ-内毒素编码的基因和嗜暗变种δ-内毒素编码的基因。2.按照权利要求1的杂交株细菌细胞，能够产生B.T.柯氏变种各自典型的δ-内毒素晶体。3.杂交株细菌细胞，是通过产生δ-内毒素晶体的柯氏变种和产生δ-内毒素晶体的嗜暗变种的接合...

【专利技术属性】
技术研发人员：迪米特里卡拉马塔，让克里斯托夫皮奥，让一克里斯托夫皮奥，
申请(专利权)人：山道士有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]