刺激胰腺活性的一种新的蛋白分解复合物的生产方法及其在畜牧业中的应用技术

本发明专利技术涉及：—一种新的蛋白分解复合物的生产方法，此蛋白分解复合物是用一株新霉素链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅ），在培养基ｐＨ保持在７和７．５之间经过培养之后生成的，然后在一种澄清剂存在条件下过滤，再通过一种特异膜超滤，提取所述之复合物，最后进行雾化加工；—一如此获得的新的蛋白分解复物；—一其畜牧业应用，这是由于它对胰腺活性的刺激作用。（*该技术在2008年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
申请人曾在他的法国专利No2034559中描述过一种从新霉素链霉菌(Streptomycesfradiae)生产蛋白分解复合物的方法，以及这些复合物在畜牧业中可能具有的特殊作用。实验表明，应用此专利年所得出的结果一般都是肯定的，但不规律或不够充分，以及这些复合物的使用受到很大限制。本申请旨在描述一种能获得一种新的、特定的有更精确固定组成的复合物的方法，并确定使此新的复合物有规律地给与畜牧业以某些重要改进的条件。本申请还涉及根据本方法获得的新的蛋白分解复合物。SHIONOGI公司在其英国专利No1133579中曾说明，新霉素链霉菌至少能生产5种蛋白酶和2种肽酶，5种蛋白酶分别用Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ表示。申请人同时还从新霉素链霉菌中获得了另一些酶，这些酶实际上与SHIONOGI的专利所描述的酶属同一类型，有着同样的普通特性。为易于说明起见，本申请采用了与上述专利同样的罗马数字来标明这些酶。申请人曾经证实，只由蛋白酶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型组合的复合物引起肠粘液的粘度中等降低，这是在他的原始专利中规定了的，并且这些复合物一般在畜牧业中所得出的结果是肯定的，但不规律或不够充分;在所有的这些复合物中间只有特定的其蛋白酶Ⅱ型的含量高于Ⅲ型或Ⅳ型的复合物，才可以有规律地给予畜牧学特性的重大改进。申请人还曾证实，由5种类型的蛋白酶和2种类型的肽酶组成的总复合物，引起肠粘液粘度的过分降低，并且对粘液有破坏性;因此，不可以将这些复合物用于畜牧业中。所以，人们曾设法获得特定的，只由蛋白酶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型组合的复合物，其中以蛋白酶Ⅱ型占优势。生产方法根据本专利技术的复合物是在下列条件下获得的发酵利用一株新霉素链霉菌，例如存放在美国菌种保藏中心(缩写ATCC)，存放号为10.745的WAKSMAN3535模式株。通过经典的分离技术，在琼脂培养基上定期进行菌株的更新，以去掉偶尔出现的蛋白分解活性低的某些自生突变株。也可以用经典诱发突变的技术改良此菌株，以便提高其蛋白分解活性。首先用细颈玻璃瓶震荡培养，然后在一中间发酵罐里制备此菌株的前培养物，接着再将前培养物接种到工业发酵罐内。生产培养基可由下列成分组成大豆粉15g/l;葡萄糖30g/l;磷酸氢二钾1g/l;碳酸钙10g/l;灭菌后，pH约为7.0;发酵温度固定在28℃，并按培养基单位容积每分钟通入0.3单位容积的无菌空气。培养基pH初始时为7.0左右，培养初期开始下降，经过约10小时发酵后，培养基pH下降至6.5;随后又迅速上升，约经20小时发酵后达到7.5，然后继续缓慢上升，最终达到8.2。已证实，至关重要的是自动加入某种酸性溶液，例如3N盐酸，使pH保持在7.5和7.0之间，这就可以-避免菌丝体断裂以免在培养基内释放某些次生代谢产物、蛋白酶Ⅰa及Ⅰb型和某些肽酶;这些次生代谢产物以及这些酶便仍然保留在细胞内;-增加蛋白酶Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型的产量，这些酶基本上都是胞外酶;-获得蛋白酶Ⅱ型产量特别巨大的增长。发酵持续时间可能在72至96小时之间变化，并且培养基的最终效价约为15，000安森单位(UnitésAnson)/ml;因而大大超过法国专利No2034559所述的3000安森单位/ml。在这里把1安森单位(缩写U.A.)定义为，定量的酶在变性的血红蛋白存在条件下，于25℃，pH7.5，保温10分钟，由此底物释放出1μg酪氨酸的当量，用分光光度计测定在280nm波长下三氯醋酸非沉淀性滤液的光吸收提取。通过澄清过滤，将菌丝体与生产培养基分离。用一种较新的超滤法提取复合物，代替了用分离酶的经典技术(连续沉淀，过柱)提取复合物。曾研究过什么样的超滤膜才能导致最好收率;具备一个相应于30，000分子量的孔径阈值的膜，由于有50%以上的复合物可以通过而不适用;具备一个相应于1，000分子量的孔径阈值的膜，不能使复合物与一些低分子量次生代谢产物分离，所以也不适用;业经证实，具备一个相应于2，000和12，000分子量之间的孔径阈值的膜才适合使用;例如MILLIPORE公司出售的聚砜膜就可以使用，这种商品名为PTGC的膜的孔径阈值相应于10，000分子量。超滤获得浓缩物，接着进行雾化加工。最后获得的复合物呈粉状，浅淡灰褐色，不算雾化前后偶尔加入的诸如经过高度干燥的淀粉之类的惰性支持物，其效价至少为2，000U.A./mg。蛋白分解活性的总收率约为70%，高于通过连续沉淀或过柱法而从工业上获得的收率。提要要从一株新霉素链霉菌中获得所需的蛋白分解复合物，宜加入一种无机酸或有机酸溶液，保持培养基pH在7.5和7°之间，然后在一种澄清剂存在条件下过滤，再用一种孔径阈值相应于2，000和12，000之间的分子量的膜进行超过滤，提取蛋白水解复合物，最后进行雾化加工。特别宜于使用存放于ATCC内的，存放号No10745的WAKSMAN3535模式株作为新霉素链霉菌菌株，宜于用3N盐酸使培养基pH保持在7.5和7之间，并且宜采用商品名为PTGC、由MILLIPORE公司销售的一种聚砜膜作为超过滤膜。新复合物的特性·具有除去蛋白酶Ⅰa，Ⅰb型以及肽酶的蛋白酶Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型(由酶电泳测定);·蛋白酶Ⅱ型占优势，它至少具有蛋白分解总活性的40%，而蛋白酶Ⅲ型或Ⅳ型每种至多仅具有此总活性的30%。组成这种新复合物的蛋白酶的特性·蛋白酶Ⅱ型的分子量为18，000左右，等电点为9.0左右;于pH8.0电泳，以相对缓慢的速度朝阴极方向移动。·蛋白酶Ⅲ型的分子量为14，000左右;等电点为9.0左右;于pH8.0电泳，以中等速度朝阴极方向移动;·蛋白酶Ⅳ型的分子量为16，500左右;等电点为9.0左右;于pH8.0电泳，以相对快的速度朝阴极方向移动;·蛋白酶Ⅳ型的分子量为16，500左右;等电点为9.0左右;于pH8.0电泳，以相对快的速度朝阴极方向移动。在畜牧业中的应用按本专利技术所述之复合物应用于畜牧业中，一旦这些应用符合下列条件时会获得最理想的结果使用粗蛋白含量高的饲料业经证实，复合物刺激动物生长，与产生脂肪比较，趋于优先生产蛋白质。例如曾试验观察到，经处理的小牛和猪肉块由于肌肉多、脂肪少，所以常被从优确定品级，但同时也观察到这些改良是不规律的。于是便有假设认为，复合物这种刺激蛋白质合成代谢的趋向只是在所用的饲料含有足够量的粗蛋白条件下才能充分显示出来。实验实际肯定了，为要有规律地获得对蛋白质合成代谢显著的刺激作用，要遵循的实验条件之一在于利用一种粗蛋白相对丰富的饲料，即总含氮率较高的物质(缩写M.A.T.)。例如，此高比率M.A.T.应为饲养雏鸡用的饲料≥23%小牛或羊羔哺乳期用的饲料≥22%仔猪断乳期用有饲料≥20%仅供母猪怀孕期和授乳期用的饲料≥16%使用这样一些饲料一般说不符合当前实际，因为-动物不总是能够全部同化含有高比率M.A.T.的饲料;那么没有消化的蛋白质就会由于蛋白分解性细菌的过量生长发育造成肠道区系的不平衡，并造成腹泻频率的增加。使用复合物就能准确地消除这些危险，因为它赋予动物以有效地同化高比率M.A.T饲料的能力。-高比率M.A.T饲料价格高于普通饲料，用复合物作为其添加剂，则价格还要高。可是，这种价格提高会得到补偿，因为复合物可以容许使用一种能量含量低于目前标准的饲料。随着畜牧学特性的巨大改进，无论如何本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白分解复合物的生产方法，此复合物是在一株新霉素链霉菌的作用下经地酵后生成的，其特征在于，在培养基内加入了一种无机酸或有机酸溶液，以保持ｐＨ在７．５和７．０之间，在加入一种澄清剂的条件下过滤，然后在一种孔径阈值相应于分子量２，０００和１２，０００之间的膜上超滤，进行蛋白分解复合物的提取，取后再经过雾化加工。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：米歇尔胡亚里曼，
申请(专利权)人：米歇尔胡亚里曼，多明妮胡亚里曼，丹尼斯胡亚里曼，让诺埃尔胡亚里曼，埃尔韦胡亚里曼，
类型：发明
国别省市：FR[法国]