一种醛缩酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种醛缩酶及其编码基因和应用。醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示。所述应用是该醛缩酶在生产他汀类药物中间体中的应用。本发明专利技术在嗜热菌野生型醛缩酶的基础上，对其编码基因进行随机突变叠加定点突变，获得双突变基因，该双突变基因表达的醛缩酶不仅保有了野生型醛缩酶的抗底物变性能力，其催化活性也大大提高；利用该酶催化乙醛和氯乙醛发生羟醛缩合反应，其催化效率比野生型醛缩酶提高了3倍；表明本发明专利技术的醛缩酶具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种醛缩酶及其编码基因和应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种醛缩酶及其编码基因和应用。
技术介绍
他汀类药物是降血脂主要药物，其结构中均带有侧链(3R，5S)-二羟基酯结构，该结构可作为甲羟戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，抑制HMG-CoA向甲羟戊酸的还原性转化，进而降低低密度脂蛋白胆固醇的水平，从而达到降低血脂的目的。他汀类药物虽然化学结构相对简单，但其制备过程难度较大，原因有两个，一是侧链(3R，5S)-二羟基酯具有2个手性中心，难以通过一步反应完成；二是侧链(3R，5S)-二羟基酯在他汀类分子中的对映体过量(e.e.)和非对映体过量(d.e.)值分别大于99.5％和99％，使得对映体的拆分比较困难。这些因素都导致他汀类药物侧链合成产率较低，成本较高。生物催化是解决当前问题的重要途径。目前，已经发现有生物酶对羟醛缩合反应有催化效果，其中研究较为广泛的是大肠杆菌的醛缩酶DERA，其能催化生成具有两个手性中心的的产物，例如能催化乙醛和氯乙醛发生羟醛缩合反应，生成6-氯-(3R，5S)-二羟基醛，6-氯-(3R，5S)-二羟基醛会自动环化为(4R,6S)-2,4-二羟基-6氯甲基吡喃：(4R,6S)-2,4-二羟基-6氯甲基吡喃可作为他汀类药物侧链合成的一个重要中间体。但由于大肠杆菌的醛缩酶存在催化醛缩反应活性不高，抗底物变性能力差等问题，难以适应大规模的工业化生产。文献(Directedevolutionofanindustrialbiocatalyst:2-deoxy-D-ribose5-phosphatealdolase.StefanJennewein,MartinSchürmann,MichaelWolberg,IrisHilker,RuudLuiten,MarcelWubboltsandDanielMink.Biotechnol.J.2006,1,537–548)对大肠杆菌的醛缩酶进行定向进化，突变后的醛缩酶虽然酶活力与抗底物变性能力有所提高，但相对工业生产中所需的较高的乙醛和氯乙醛浓度而言，其抗乙醛和氯乙醛变性能力仍然比较有限，仍旧难以适应大规模生产的需求。嗜热菌Pyrobaculumaerophilum所表达的醛缩酶，其抗底物变性能力较强，但其催化活性较低，若能在保持其抗底物变性能力的基础上提高其催化活性，将大大降低制备他汀类药物的难度。
技术实现思路
本专利技术提供了一种醛缩酶，该醛缩酶具有高催化活性，且抗底物变性能力很强。一种醛缩酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供了一种编码所述醛缩酶的基因，该基因的碱基序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术对嗜热菌(Pyrobaculumaerophilum)野生型醛缩酶的编码基因进行突变，将174位编码异亮氨酸的密码子(ATT)突变为编码缬氨酸的密码子(GTT)，将187位编码缬氨酸的密码子(GTG)突变为编码异亮氨酸的密码子(ATT)。所述醛缩酶的制备方法为：(1)以嗜热菌(Pyrobaculumaerophilum)野生型醛缩酶的编码基因为模板，进行易错PC扩增，以扩增片段构建重组载体，获得突变基因文库；(2)将突变基因文库转化感受态细胞，构建突变文库；(3)利用诱导物诱导突变文库表达，获得表达文库；(4)对表达文库进行酶活分析和序列测定，筛选目的突变基因；通过上述方法，本专利技术先筛选出了两个目的突变基因，这两个目的突变基因的点突变分别发生在174和187位，这两个目的突变基因表达的醛缩酶，其催化活性比野生型醛缩酶和含有其他突变基因的重组工程菌所产的醛缩酶均有所提高。(5)以上述目的突变基因为基础，进行定点突变，获得双突变基因；在步骤(4)的基础上，本专利技术以174位的目的突变基因为模板，对其187位进行定点突变，获得发生在174位、187位的双突变基因；以187位的目的突变基因为模板，对其174位进行定点突变，也能获得发生在174位、187位的双突变基因。(6)构建含有双突变基因的重组工程菌，诱导培养后对获得的粗酶液进行分离纯化，得到醛缩酶。该双突变基因表达的醛缩酶，其催化活性比单独突变的基因所产的醛缩酶又有所提高，由此获得本专利技术的醛缩酶。本专利技术中，进行174位定点突变所用的引物为：上游引物：5’-GGAGAGGGCGGCGGCAGTTGCCCGCTACATAAAAGAG-3’(SEQIDNo.4)；下游引物：5’-CTCTTTTATGTAGCGGGCAACTGCCGCCGCCCTCTCC-3’(SEQIDNo.5)；进行187位定点突变所用的引物为：上游引物：5’-GGTATAGACTGGGGATTAAAATGGCGGGGGGGATTAGG-3’(SEQIDNo.6)；下游引物：5’-CCTAATCCCCCCCGCCATTTTAATCCCCAGTCTATACC-3’(SEQIDNo.7)。本专利技术还提供了含有所述基因的表达单元、重组载体或转化子。作为优选，所述表达单元的启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，醛缩酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。所述重组载体的原始载体可选用PET21a、PET28a、PET30a。作为优选，宿主细胞为大肠杆菌。本专利技术还提供了所述醛缩酶在生产他汀类药物中间体中的应用。如未作特殊说明，本专利技术中所述他汀类药物中间体是指(4R,6S)-2,4-二羟基-6氯甲基吡喃。本专利技术的醛缩酶不仅保有了野生型醛缩酶的抗底物变性能力，其催化活性也大大提高；利用该酶催化乙醛和氯乙醛发生羟醛缩合反应，其催化效率比野生型醛缩酶提高了3倍，比文献(Directedevolutionofanindustrialbiocatalyst:2-deoxy-D-ribose5-phosphatealdolase.StefanJennewein,MartinSchürmann,MichaelWolberg,IrisHilker,RuudLuiten,MarcelWubboltsandDanielMink.Biotechnol.J.2006,1,537–548)中公开的大肠杆菌醛缩酶突变体提高了8倍。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术在嗜热菌(Pyrobaculumaerophilum)野生型醛缩酶的基础上，对其编码基因进行随机突变叠加定点突变，获得双突变基因，该双突变基因表达的醛缩酶不仅保有了野生型醛缩酶的抗底物变性能力，其催化活性也大大提高；利用该酶催化乙醛和氯乙醛发生羟醛缩合反应，其催化效率比野生型醛缩酶提高了3倍；表明本专利技术的醛缩酶具有良好的工业应用前景。附图说明图1为定点突变的原理示意图；图2为本专利技术双突变基因DERApya(I174V,V187I)的电泳检测结果图；图3为构建有本专利技术双突变基因的质粒pET28a(+)-DERApya(I174V，V187I)的基因图谱；图4为图3所示质粒的电泳检测结果图；图5为本专利技术重组工程菌所产粗酶液的电泳检测结果图；其中，Marker表示蛋白质分子量标准；DERApya(I174V,V187I)表示重组工程菌所产粗酶液；图6为DERApya(I174V,V187I)催化体系中产物6-氯-(3R，5S)-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种醛缩酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种醛缩酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种编码如权利要求1所述醛缩酶的基因，其特征在于，碱基序列如SEQIDNo.2所示。3.一种含有如权利要求2所述基因的表达单元。4.如权利要求3所述的表达单元，其特征在于，启动子为T...

【专利技术属性】
技术研发人员：金志华，吴志革，金庆超，杨郁，蔡伟，张鑫红，戎凯，
申请(专利权)人：浙江大学宁波理工学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33