嵌合型人γ-干扰素受体/免疫球蛋白多肽制造技术

本发明专利技术涉及嵌合型γ－干扰素受体／免疫球蛋白多肽和编码该嵌合型多肽的ＤＮＡ顺序及其制备方法。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
γ-干扰素(IFNγ)是由NK细胞和激活的辅助T淋巴细胞产生的一种蛋白质，它具有抗病毒和抗增殖活性，在调节免疫系统和炎症反应方面起着多效作用。γ-干扰素调节抗体的形成和T淋巴细胞或NK细胞的分化，增强数种细胞类型上主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类和Ⅱ类结构的表达，因而扩增了辅助细胞的抗原提显能力。γ-干扰素通过作用于吞噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞，在激活非特异性防御机制中起着重要作用。γ干扰素是巨噬细胞杀微生物和杀肿瘤特性的主要激活剂，它增强吞噬作用，诱导ADCC(抗体依赖性细胞毒性)，并调节下列物质的释放MHCⅢ类基因编码的多肽(即补体成分和TNFα)、蛋白酶抑制剂(C1抑制剂)、IL1、GM-CSF、纤维连接素、花生四烯酸代谢物、1，25-羟基维生素D3、溶酶体酶(IP-30、水解酶、中性蛋白酶，即uPA)和趋化性因子(IP-10)。最后，TFNγ还促进细胞间的相互作用、吞噬细胞通过结缔组织的迁移以及对细胞外基质糖蛋白的趋化和粘连(Landolfo和Garotta，J.Immunol.Res.3，81-94)。多种动物实验表明，IFNγ在诱发或促进下列疾病方面起着关键性作用，所说疾病包括胰岛素依赖性糖尿病、全身性红斑狼疮、甲状腺炎、多发性硬化、暴发型肝炎、异体移植排斥反应、血栓形成和继发于一般性施瓦茨曼型反应的出血。另外，IFNγ在促进Kawasaki病(皮肤粘膜淋巴结综合征)和见于一些类肉瘤病患者中的高血钙(1，α-甾醇-羟化酶能将维生素D3转化为其最具活性的形式1，25-二羟基维生素D3，而IFNγ能诱导1，α-甾醇-羟化酶水平的升高)中也有作用(Garotta等人，Pharmacol.Res.21，5-17;Landolfo和Garotta，同上文;Gilles等人，Hepatology16，655-663，)。在艾滋病(AIDS)的发病机理中，组织巨噬细胞在建立慢性感染状态中有作用。因为它们代表人免疫缺陷病毒(HIV)的重要贮存库。体外实验表明，IFNγ增强被感染的巨噬细胞表达成熟的HIV，并能够恶化该疾病的进程(Ganser等人，Onkologie 9，163-166，Biswas等人，J.Exp.Med.，176，739-750)。最后，IFNγ在炎性神经病性疾病中或在AIDS、脊髓灰质炎病毒感染、莱姆病和败血症的神经病性并发症中起重要作用。IFNγ激活的巨噬细胞将L-色氨酸转化为神经毒素喹啉酸(Heyes等人，Biochem.J.283，633-635)。借助交联实验、与放射性同位素标记的IFNγ结合以及与未标记的IFRγ的特异性竞争实验已证实了在多种细胞上存在的IFNγ的特异性受体(IFNγR)。Rubinstein等人(Immunol.Rev.97，29-50[1987)已描述了人IFNγ(hIFNγ)和人IFNγ受体(hIFNγR)之间的交联复合物，其分子量(Mr)范围是70，000～165，000，尽管存在着这一明显的异质性，但对不同细胞类型进行的结合和结构性研究表明只有一种表观分子量为90KDa的IFNγ结合蛋白(p90)和一类离解常数约为10-11～10-10M的结合位点(Sarkar和Gupta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，5160-5164;Aguet和Merlin，J.Exp.Med.165，988-999;Calderon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，4837-4841;Fountoulakis等人，J.Immunol.143，3266-3276;Van Loon A.P.G.M等人，J.Leukocyte Biol.，49，462-473)。另外一种能被检测到的hIFNγR的50Kd成分(p50)是p90蛋白的蛋白水解降解产物(Aguet和Merlin，同上文;Sheehan等人，J.Immunol.140，4231-4237;Fountoulakis等人，同上文;Van Loon A.P.G.M.等人，同上文)。因为hIFNγR的这一p50成分包括细胞外功能区、跨膜区和部分细胞内功能区，所以，它不是天然存在的hIFNγR的可溶形式(Fountoulakis等人，同上文;Van Loon A.P.G.M.等人，同上文)。总之，IFNγR是一种普遍存在的膜锚蛋白(Valente等人，Eur.J.Immunol.22，2403-2412)，它似乎在正常细胞上被表达的程度(每个细胞最多达103位点)低于在肿瘤细胞上的表达程度。因此，据报道一些人癌细胞系和B细胞系以每个细胞104结合位点的数量级表达IFNγR(Uecer等人，Cancer Res.46，5339-5343;Aguet和Merlin，同上文)。已经描述过hIFNγR的分子克隆和表达(Aguet等人，Cell55，273-280)。然而，因为天然IFNγR以及重组IFNγR是膜锚蛋白，所以它们存在着不溶于生理性溶液的不利之处。因此，难以实现IFNγ拮抗剂的研究或设计以及给哺乳动物施用纯化的IFNγR以抑制IFNγ与其特异性受体的结合，从而难以预防、抑制和/或调节自身免疫紊乱、慢性炎症、迟发型过敏反应和异体移植排斥反应的病程。通过培养携带含有编码各个可溶形式IFNγR的DNA顺序之表达载体的转化株并分离这种可溶性IFNγR得以将可溶形式的人IFNγR和可溶形式的小鼠IFNγR工程化。所说的shIFNγR包括天然IFNγR中从N末端部分到跨膜区的整个细胞外功能区(至少是天然IFNγR顺序的氨基酸26-246)，但缺乏天然IFNγR的胞质区和跨膜区，并能够特异地结合IFNγ(Fountoulakis等人，J.Biol.Chem.265，13268-13275，Gentz等人，Eur.J.Biochem.210-545-554和欧洲专利申请393502)。该可溶形式IFNγR的分子量约为30-32KDa，以约10-10M的亲和力结合IFNγ，在体内有活性并且是稳定的，它不是免疫原，能作为特异性中和内源性IFNγ的药物加以应用。因此，该可溶形式IFNγR能够用于治疗胰岛素依赖性糖尿病、全身性红斑狼疮、多发性硬化、暴发型肝炎、甲状腺炎、异体移植排斥反应、脓毒性腹膜炎和施瓦茨曼型反应以及由IFNγ激活的巨噬细胞释放的神经毒性喹啉酸所致的炎性神经病性疾病。另外，可将该可溶形式IFNγR应用于AIDS患者，以迟缓感染的慢性化，延长疾病的无症状期并预防神经病性并发症。该可溶形式的IFNγR还可作为IFNγ拮抗剂加以应用，以防止脊髓灰质炎病毒感染、莱姆病和败血症的神经病性并发症。然而，该可溶形式的IFNγR在血中仅持续存在1-3小时。在淋巴样器官中存在6小时(Ozmen等人，J.Chemotherapy 3，Suppl.3，99-102;Ozmen等人，J.Immunol.Methods 147，261-270;Gentz等人，同上文)。通过将可溶形式的小鼠IFNγR与小鼠免疫球蛋白恒定区部分相结合产生嵌合型小鼠IFNγR-免疫球蛋白多肽(Kürschner等人，J.Biol.Chem.267，9354-9360)能够增加IFNγR在血液及淋巴样本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有两部分ＤＮＡ顺序结合的ＤＮＡ顺序，其中一部分顺序编码入γ－干扰素受体的片段，该片段结合入γ－干扰素，另一部分顺序编码人免疫球蛋白重链或轻链（如ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ或Ｃｋ）的部分或全部恒定区。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：Z登姆比克，G加罗塔，R詹茨，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]