嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CARMSLN-NKT细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CARMSLN‑NKT细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体为MSLNScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、MSLNScFv、缩短的CD8铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。采用本发明专利技术的CARMSLN‑NKT细胞与MSLN阳性的间皮瘤细胞共培养时，对间皮瘤细胞具有很好的特异杀伤活性。

The expression of chimeric antigen receptor gene and recombinant vector, CARMSLN NKT cell and preparation method and application thereof

The invention discloses a chimeric antigen receptor gene and recombinant expression vector, CARMSLN NKT cells and a preparation method and application of the chimeric antigen receptor for MSLNScFv CD8 CD137 CD3 zeta, signal domains including CD137 CD8 hinge region of CD8a signal peptide, MSLNScFv series and shortened and transmembrane region the intracellular signaling domain and intracellular CD3. The invention of the CARMSLN NKT cells and MSLN positive mesothelioma cells co cultured with specific killing activity, good for mesothelioma cells.

【技术实现步骤摘要】
嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CARMSLN-NKT细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化MSLN靶向性的NKT细胞(CARMSLN-NKT细胞)及其制备方法和应用。
技术介绍
自然杀伤细胞(NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，在TCR和NKR介导下，NKT细胞能够产生大量的IL-4及INFγ，对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。NKT细胞通过自身表面的CD16与特异性抗体的Fc段结合，发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC，antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)。但在抗体依赖的细胞介导的杀伤作用过程中，由于抗体能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，NKT细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，因此抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，但NKT细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。另外，通常情况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复多次输注。而且，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了NKT细胞对恶性肿瘤的靶向治疗。再者，研究表明，NKT细胞并不是对所有的肿瘤都有杀伤效果，且对部分肿瘤的杀伤作用比较弱，特异杀伤活性有待提高。间皮素(MSLN)是一个40kDa的表面糖蛋白，表达于多种肿瘤细胞表面，如恶性间皮瘤、胰腺瘤、卵巢癌等，其中恶性胸膜间皮瘤MSLN的表达率达到90％以上，而在正常组织呈现低表达的现象。研究发现，MSLN与肿瘤的进展、转移及患者较低生存率有很大的相关性。由于以上特性，MSLN抗原成为抗体为基础治疗的理想靶点。目前，大量研究采用MSLN单克隆抗体或MSLN疫苗的方案靶向杀伤MSLN阳性的肿瘤细胞，然而，这些方案在产生一定效应的基础上，同时也存在一定的缺陷，如：MSLN单克隆抗体靶向效应的短暂性及MSLN单克隆抗体在肿瘤部位分布的不足等。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高以及现有临床研究中MSLN单克隆抗体及疫苗靶向治疗存在的上述的缺陷，提供一种嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化MSLN靶向性的NKT细胞(CARMSLN-NKT细胞)及其制备方法和应用。本专利技术的专利技术人在研究中意外发现，采用本专利技术的嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞与MSLN阳性的间皮瘤细胞共培养时，对间皮瘤细胞具有很好的特异杀伤活性。因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、MSLNScFv、缩短的CD8的铰链区(hinge区)和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。第二方面，本专利技术提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。第三方面，本专利技术提供了含有上述基因的重组表达载体。第四方面，本专利技术提供了一种工程化MSLN靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上述嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞。第五方面，本专利技术提供了一种工程化MSLN靶向性的NKT细胞的制备方法，所述方法包括：包装携带PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ。第六方面，本专利技术提供了上述方法制备得到的工程化MSLN靶向性的NKT细胞。第七方面，本专利技术提供了上述工程化MSLN靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。在与MSLN阳性的间皮瘤细胞共培养时，本专利技术的嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，即工程化MSLN靶向性的NKT细胞能够特异性结合MSLN抗原，增强免疫细胞靶向识别癌细胞表面MSLN抗原的能力，加强对MSLN阳性间皮瘤细胞的特异杀伤活性。本专利技术的工程化MSLN靶向性的NKT细胞为治疗MSLN阳性的肿瘤提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。图2为本专利技术的慢病毒表达载体PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶MluI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。图3为本专利技术的慢病毒表达载体PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶BamHI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。图4为本专利技术的慢病毒表达载体PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的结构示意图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒浓缩液对NKT细胞的感染效率。图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(CARMSLN-NKT细胞)表型鉴定的结果。图7为本专利技术的CARMSLN-NKT细胞对MSLN阳性的间皮瘤细胞的杀伤作用的细胞毒性分析图。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、MSLN单链抗体MSLNScFv、缩短CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。优选情况下，嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ由CD8a信号肽、MSLNScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。进一步优选地，嵌合抗原受体具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，更进一步优选地，嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，所述基因具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，进一步优选地，编码上述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ。对于慢病毒表达载体PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为MSLNScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、MSLNScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、MSLNScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的基因，优选地，所述基因具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，进一步优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求2所述的基因的重组表达载体，优选地，所述重组表达载体为慢病毒表达载体，进一步优选地，所述慢病毒表达载体为PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ。4.一种工程化MSLN靶向性的NKT细胞，其特征在于，所述NKT细胞是由权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的NKT细胞。5.一种工程化MSLN靶向性的NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：包装携带PWPT-MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体MSLNScFv-CD8-CD137-CD3ζ。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法还包括通过如下方法制备NKT细胞：(1)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶段培养；优选地，所述第一阶段培养的实施方式包括：将单个核细胞培养于第一NKT细胞培养液中，所述第一NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15；进一步优选地，第一NKT细胞培养液中，所述CD3单克隆抗体的浓度为30-70ng/mL，和/或所述白介素-2的浓度为300-700U/mL，和/或所述白介素-15的浓度为30-...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：伍志强，
类型：发明
国别省市：北京,11