靶向CD30抗原的转基因T细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，为染色体中整合有SEQ ID NO:2所示的编码靶向CD30抗原的基因、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，或：包含有重组慢病毒表达载体(包含有SEQ ID NO:2所示的编码靶向CD30抗原的基因，以及靶向PD1基因的shRNA或/和靶向CTLA4基因的shRNA)的原始细胞；所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。制备方法为：(1)慢病毒感染CD4+T细胞或CD8+T细胞；(2gRNA、CRISPR‑cas9mRNA、HDR混合，电转重组T细胞，即得。本发明专利技术在carT构建中，引入了EGFR的识别序列，必要时可用EGFR单抗Cetuximab消除carT细胞，并且敲除或沉默了PD1、CTLA4基因，解除了其对carT细胞的抑制，增强了carT细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。

Transgenic T cells targeting CD30 antigen and their preparation methods and Applications

The invention discloses a target antigen of CD30 transgenic T cells for chromosome encoding target SEQ ID integration NO:2 shown to the CD30 antigen gene, and knock out the PD1 gene or CTLA4 gene and / or primitive cells: contains a recombinant lentiviral vector (containing gene. SEQ ID NO:2 encoding target shown to CD30 antigen and PD1 gene targeted shRNA or / and shRNA) targeting the CTLA4 gene of the primitive cells; the original cells were CD4+T cells or CD8+T cells. The preparation method is as follows: (1) lentivirus infected CD4+T cells or CD8+T cells; (2gRNA, CRISPR cas9mRNA, HDR mixed, electroporation of recombinant T cells, i.e.. The present invention in the process of carT construction, introduces the recognition sequence of EGFR, EGFR mAb Cetuximab can be used when necessary to eliminate carT cells, and knockout or silence PD1 gene and CTLA4 gene, remove the inhibition effects on carT cells, enhanced carT cells overcome tumor microenvironment to suppress the immune function.

【技术实现步骤摘要】
靶向CD30抗原的转基因T细胞及其制备方法与应用
本专利技术涉及靶向CD30抗原的转基因T细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
恶性淋巴瘤是淋巴结和结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤，来源于淋巴细胞或组织细胞的恶变。是青年人中最常见的恶性肿瘤之一。病变主要发生在淋巴结，以颈部淋巴结和锁骨上淋巴结最为常见，其次是纵隔、腹膜后、主动脉旁淋巴结。病变从一个或一组淋巴结开始，通常表现由原发灶沿淋巴道向邻近淋巴结有规律的逐站播散。晚期可发生血行播散，侵犯血管，累及脾、肝、骨髓和消化道等部位。在我国，恶性淋巴瘤近年来新发病例逐年上升，每年至少超过25000例，而在欧洲、美洲和澳大利亚等西方国家的发病率可高达11/10万～18/10万，略高于各类白血病的总和。在美国每年至少发现新病例3万以上。我国恶性淋巴瘤的死亡率为1.5/10万，占所有恶性肿瘤死亡位数的第11～13位，与白血病相仿。霍奇金淋巴瘤(HL)占全部肿瘤的0.1％～0.2％。年发病率1/10万～4/10万人口，在亚洲较少见。我国上海市1989年统计标准化年发病率1.1/10万人口，在淋巴瘤中占16.5％～22.5％(西方国家为34.6％～51.6％)。男性多于女性(1.3～1.4∶1)。发病年龄发达国家呈双峰分布，第1年龄高峰在15～35岁，第2年龄高峰在55岁以后。我国和日本发病无年龄的双峰分布，发病者多为40岁左右。非霍奇金淋巴瘤(NHL)占中国全部淋巴瘤病例的90％左右，并且近十几年来发病率逐年升高，分为B细胞型和T/NK细胞型两大类。B细胞型淋巴瘤占70％左右，又进一步分为高度侵袭性、侵袭性和惰性淋巴瘤三大类；T/NK细胞型淋巴瘤约占30％，主要分为高度侵袭性和侵袭性两大类。石远凯主编的《淋巴瘤》一书中指出，PTCL在我国和其他亚洲国家发病率约占所有NHL的29.6～39.1％，中位生存期大约2年。2015年12月，美国Baylor医学院临床试验在美国血液病年会初步报道，anti-CD30-CD28-CD3zeta构建临床试验9患者，2CR，4PR，3PD。抗CD30的单抗药物Brentuximabvedotin给药1次，初始剂量为0.1mg/kg，最高剂量为3.6mg/kg，17例(38％)患者发生客观反应，其中包括11例完全缓解(25％)。当给药剂量达到最大耐受剂量(1.8mg/kg)时，接受治疗的12例患者中客观反应率为50％(6例)，副作用主要是疲劳、发热、腹泻、恶心、嗜中性白血球减少和外周神经病变等。在另一项I期临床试验中，患者每周给药一次(4周一个疗程，前3周给药)，初始剂量为0.4mg/kg，最高剂量为1.4mg/kg，85％的患者肿瘤有消退，59％的患者发生客观反应，其中34％的患者完全缓解。carT技术的基本原理嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体(singlechainfragmentvariable，scFv)和免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM，通常为CD3-ζ和FcεRIγ)组成。早期的实验证明了CAR-T的可行性，然而第一代CAR只能引起短暂的T细胞增值和较低的细胞因子分泌，不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。依照T细胞活化的双信号学说，T细胞的激活和增殖需要共刺激信号；第二代、第三代CAR引入了共刺激分子信号序列(costimulatorymolecule，CM)，旨在提高T细胞的细胞毒活性、增殖性与存活时间，促进细胞因子的释放。现有的国内外第2代carT细胞培养技术，大致遵循类似的技术路线，即在分离患者外周血单个核细胞后，起始培养1～2天后，转染逆转录病毒(retroviral)，或慢病毒(lentiviral)，或转座子(transponson)为载体的基因表达嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)分子，加共刺激因素(IL2等生长因子，辅助以CD3CD28抗体，或者抗原表达的细胞株等)培养7～30天后，回输患者。欧美少量临床试验的数据表明，现有的CD30chimericantigenreceptorT(carT)技术，治疗顽固性霍奇金淋巴瘤(HL)响应率66％，高于单抗药物Brentuximab-vedotin38％。存在的临床不足如下：1、患者在治疗过程中需要密切监护，有中度的CRS，主导原因之一是数十倍于正常水平的血清IL6。欧美临床对此有比较好的处理方案，主要是IL6R单抗或大剂量类固醇激素。2、治疗有效率低于典型的CD19carT70～90％完全治愈率(CR)，有效率有待提高，有待于克服肿瘤微环境的抑制。3、长期存在的CD30carT可能对患者有持久毒性。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，及其制备方法。本专利技术在carT构建中，引入了EGFR的识别序列，必要时可用EGFR单抗Cetuximab消除carT细胞，并且敲除或沉默了PD1、CTLA4基因，解除了其对carT细胞的抑制，增强了carT细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种靶向CD30抗原的受体，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其结构为：anti-CD30AC10scFv-CD27Hinge-TM-CD28-41BB-CD3zeta。一种编码上述靶向CD30抗原受体的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；其结构为：anti-CD30AC10scFv-CD27Hinge-TM-CD28-41BB-CD3zeta。一种重组慢病毒表达载体，其包含有上述编码靶向CD30抗原的基因。或：一种重组慢病毒表达载体，其包含有上述编码靶向CD30抗原的基因，以及靶向PD1基因的shRNA或/和靶向CTLA4基因的shRNA。本专利技术的重组表达载体的病毒包被系统，为常规方法(第2代或第3代慢病毒包被系统)；本专利技术所使用的慢病毒表达载体(lentiviralexpressionvector)SIN-3LTR的载体，母本来自1998年发表的载体序列(DullTetal(1998)Athird-generationlentivirusvectorwithaconditionalpackagingsystem.JVirol.1998Nov；72(11):8463-71.)。所述靶向PD1基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQNO.3所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQNO.4所示。所述靶向CTLA4基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQNO.5所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQNO.6所示。一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，为包含有上述重组慢病毒表达载体的原始细胞，所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向CD30抗原的受体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD30抗原的受体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种编码权利要求1所述的靶向CD30抗原受体的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种重组慢病毒表达载体，其特征在于：其包含有权利要求2的编码靶向CD30抗原的基因。4.一种重组慢病毒表达载体，其特征在于：其包含有权利要求2的编码靶向CD30抗原的基因，以及靶向PD1基因的shRNA或/和靶向CTLA4基因的shRNA。5.根据权利要求4所述的重组慢病毒表达载体，其特征在于：所述靶向PD1基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQNO.3所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQNO.4所示；所述靶向CTLA4基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQNO.5所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQNO.6所示。6.一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，其特征在于：为包含有权利要求3所述的重组慢病毒表达载体的、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，或染色体中整合有权利要求2所述的编码靶向CD30抗原的基因、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。7.一种靶向CD30抗原的转基因T细胞，其特征在于：为包含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄昕华，生德伟，于丽丽，张晋伟，庞勇，李德柱，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37