CD3单链抗体‑iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种CD3单链抗体‑iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用。本发明专利技术将穿透肽iRGD成分作为实现肿瘤主动靶向性、高穿透性的分子，将CD3的单链抗体与其连接，形成一个可以活化T细胞并能有效靶向杀伤肿瘤细胞的融合蛋白。成功构建后经反复实验验证，本发明专利技术具有明确肿瘤靶向性和高穿透性，能够切实地增强免疫细胞的抗肿瘤治疗效果，应用于抗肿瘤药物中。

【技术实现步骤摘要】
CD3单链抗体-iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用
本专利技术属于生物与新医药
，特别涉及一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用。
技术介绍
在越来越引起人们重视的免疫治疗领域，尽管存在类似于嵌合抗原受体T细胞疗法、BiTE等可以实现肿瘤的靶向性，但却在实体瘤的治疗中进展缓慢。免疫细胞难以有效进入肿瘤组织是其中一个重要的原因。因此，在免疫细胞治疗中，同时改善免疫细胞的主动靶向性与穿透性是进一步提高抗肿瘤治疗效果的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述缺陷，提供一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白（命名为anti-CD3-iRGD）同时提供上述融合蛋白的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用。本专利技术利用含有靶向穿透肽iRGD成分的物质作为实现肿瘤主动靶向性、高穿透性的分子，将CD3的单链抗体与其连接，形成一个可以活化T细胞并能有效靶向杀伤肿瘤细胞的融合蛋白。成功构建后经反复实验验证，本专利技术具有明确肿瘤靶向性和高穿透性，能够切实地增强免疫细胞的抗肿瘤治疗效果，应用于抗肿瘤药物中。本专利技术提供的技术方案是：本专利技术提供一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白，所述融合蛋白由靶向人CD3单链抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽（比如：GGGGSGGGGSGGGGS）连接组成。进一步地，所述融合蛋白包含但不限于CD3单链抗体、单域抗体、单克隆抗体以及能活化T细胞的CD3功能域或其他能活化T细胞的分子，肿瘤靶向穿透肽包含但不限于iRGD、iNGR，以及含前述靶向穿透肽结构的融合肽、融合蛋白或其它修饰成分。进一步地，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：（1）由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（2）与序列SEQIDNo.1所示的氨基酸序列同源性在80%-100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或（3）SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或者替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由（1）衍生的蛋白。本专利技术制备所述CD3单链抗体-iRGD融合蛋白的具体制备方法如下：（1）表达载体pET28a-anti-CD3-iRGD的构建：表达载体由南京金斯瑞公司合成，且已完成对该质粒的验证，包括核酸电泳及DNA测序；（2）将表达载体pET28a-anti-CD3-iRGD转化至表达菌株BL21DE3：取已经确认的100ng/μL表达载体pET28a-anti-CD3-iRGD0.1μL-5μL转化入表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克隆低温冰箱内甘油保存该菌种；（3）重组anti-CD3-iRGD的诱导表达,变性和复性，及纯化：1）重组anti-CD3-iRGD异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达：对重组anti-CD3-iRGD用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，在诱导4小时后，聚丙烯酰氨凝胶全蛋白电泳；2）重组anti-CD3-iRGD进行变复性；收集1000mL经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后的BL21菌体，用PBS、5mM咪唑重悬菌体，350W功率进行超声破碎，12000r·min−1离心后收集沉淀，用8M尿素变性剂溶解沉淀，并依次在6M、4M、2M、0M尿素溶液中透析复性；3）重组anti-CD3-iRGD经AKTAPurifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：（4）对重组anti-CD3-iRGD用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导4小时，收集菌液进行超声破碎，离心后收集沉淀，用8M尿素变性剂溶解沉淀，并依次在6M、4M、2M、0M尿素溶液中透析复性，重组anti-CD3-iRGD经AKTAPurifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：用SDS-PAGE方法检测目的蛋白。本专利技术的有益效果是：融合蛋白CD3单链抗体部分与T细胞结合，促进T细胞的多克隆增殖、活化（包括表型改变和细胞因子分泌增多）和对肿瘤细胞的杀伤作用，融合蛋白iRGD部分则通过整合素ανβ3/β5受体途径靶向至肿瘤局部，并进一步增加T细胞在肿瘤血管和实质中的穿透性。附图说明图1是目的基因表达载体pET28a-anti-CD3-iRGD核酸电泳图。泳道1：完整质粒电泳结果；泳道2：质粒经NcoⅠ和HindⅢ核酸酶酶切后电泳结果；泳道3：DNAmarker。图2是表达载体pET28a-anti-CD3-iRGD中NcoⅠ和HindⅢ位点之间序列的测序结果示意图。图3是anti-CD3-iRGD蛋白的表达与纯化：（左图）泳道1：Marker；泳道2：未诱导；泳道3：诱导后；泳道4：上清；泳道5：沉淀；泳道6：复性后。（右图）泳道1：Marker；泳道2：蛋白样品流穿；泳道3：1%咪唑洗脱蛋白；泳道4：%咪唑洗脱蛋白；泳道5：25%-100%咪唑线性洗脱蛋白，即纯化后。图4是镍柱亲和层析纯化目的蛋白图谱（箭头指示目的蛋白）。图5是融合蛋白anti-CD3-iRGD在不同浓度时能分别与MKN45细胞和T细胞表面的受体结合。（半小时后流式检测细胞表面与蛋白的结合，左图为融合蛋白与MKN45细胞表面iRGD受体的结合，右图为融合蛋白与T细胞表面CD3分子的结合）。图6是融合蛋白anti-CD3-iRGD对T细胞表面CD107a表型的作用。（24h后流式检测细胞表面与蛋白的结合，CD107a是T细胞杀伤功能的标志）。图7是融合蛋白anti-CD3-iRGD对T细胞表面CD27表型的作用（CD27是T细胞活化的标志）。图8是融合蛋白促进T细胞IFN-γ的分泌。（24h后通过ELISPOT检测T细胞IFN-γ的分泌量，右图为定量结果）。图9是融合蛋白anti-CD3-iRGD促进T细胞对MKN45的杀伤作用。（24h和48h后经LDH释放实验检测T细胞的杀伤作用）。图10是融合蛋白anti-CD3-iRGD促进T细胞在体外3D肿瘤细胞球内的穿透。（6h和24h后在共聚焦显微镜下观察T细胞在肿瘤球中的穿透作用）。图11是融合蛋白anti-CD3-iRGD促进T细胞对体外3D肿瘤细胞球的杀伤作用。（24h和48h后于倒置光学显微镜下观察肿瘤球的大小和形态）。具体实施方式以下结合附图和具体实施方式详细说明本专利技术的技术方案，但不限制本专利技术权利要求的保护范围。实施例1一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白，所述融合蛋白由靶向人CD3单链抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽（比如：GGGGSGGGGSGGGGS）连接组成。进一步地，所述融合蛋白包含但不限于CD3单链抗体、单域抗体、单克隆抗体以及能活化T细胞的CD3功能域或其他能活化T细胞的分子，肿瘤靶向穿透肽包含但不限于iRGD、iNGR，以及含前述靶向穿透肽结构的融合肽、融合蛋白或其它修饰成分。进一步地，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：（1）由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（2）与序列SEQIDNo.1所示的氨基酸序列同源性在80%-100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或（3）SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或者替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由（1）衍生的蛋白。具有抗肿瘤作用的融合蛋白的表达和纯化过程如下：1、表达载体pET28a-ant本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CD3单链抗体‑iRGD融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由靶向人CD3单链抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽连接组成。

【技术特征摘要】
1.一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由靶向人CD3单链抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽连接组成。2.根据权利要求1所述的CD3单链抗体-iRGD融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含但不限于CD3单链抗体、单域抗体、单克隆抗体以及能活化T细胞的CD3功能域或其他能活化T细胞的分子，肿瘤靶向穿透肽包含但不限于iRGD、iNGR，以及含前述靶向穿透肽结构的融合肽、融合蛋白或其它修饰成分。3.根据权利要求1所述的CD3单链抗体-iRGD融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或与序列SEQIDNo.1所示的氨基酸序列同源性在80%-100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或者替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由（1）衍生的蛋白。4.一种权利要求1所述CD3单链抗体-iR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宝瑞，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32