本申请涉及一种稳定的蛋白质。具体而言，提供一种融合蛋白，其从N端至C端包含：a)家族B的G蛋白偶联受体(GPCR)的第一部分，其包含GPCR的跨膜螺旋(TM)‑1、TM2和TM3；b)稳定的蛋白结构域；和c)GPCR的第二部分，其包含GPCR的TM4、TM5、TM6和TM7。本发明专利技术也提供使GPCR结晶的方法，包括提供本发明专利技术的融合蛋白并使之结晶以获得晶体。
【技术实现步骤摘要】
稳定的蛋白质本申请是申请号为201280049594.4，申请日为2012年8月9日，专利技术名称为“稳定的蛋白质”的中国专利申请的分案申请。
本专利技术涉及不易结晶的蛋白，并特别涉及不易稳定并因此不易结晶的GPCR。本专利技术也涉及使这种蛋白结晶的方法，以及这种蛋白的各种用途。所述蛋白可用于药物发现和开发研究。
技术介绍
GPCR组成了控制许多生理过程并且是许多有效药物靶标的一个极大的蛋白家族。特别参照Overington等人(2006)NatureRev.DrugDiscovery5,993-996，其指出现有药物中超过四分之一具有作为靶标的GPCR。其在药理学上相当重要。在Foord等人(2005)PharmacolRev.57,279-288中给出GPCR的列表，通过引用并入本文。GPCR在分离时通常是不稳定的，并且即使付出相当大努力，才仅可能使包括牛视紫质(bovinerhodopsin)在内的几种GPCR结晶，牛视紫质是天然格外稳定的并且是β-2肾上腺素受体，其作为融合蛋白结晶或者与抗体片段形成复合物结晶。人们认为GPCR以多种不同构象存在，所述构象与配体的不同药理学种类，如激动剂和拮抗剂相关，并且为行使功能在这些构象之间循环(KenakinT.(1997)AnnNYAcadSci812,116-125)。在构象之间的转换也导致在获得受体的晶体结构上的困难。虽然GPCR都具有特征性的7个跨膜(TM)结构域，基于序列同源性和分子结构，仍可将其分为三个家族(A、B和C)。最大的组家族A，由与视紫质同源的受体组成。家族B也称为肠促胰液素受体家族，其是受大肽激素如高血糖素激素家族调节的受体；该家族成员的特征在于含有几个半胱氨酸的相对大的细胞外N端，所述几个半胱氨酸形成二硫桥网络并且是配体结合袋的一部分。家族C由与代谢型谷氨酸受体同源的受体组成；这些受体的特征是极长的细胞外N端和长的羧基尾巴，且所述N端形成配体结合袋，已证明其形成二硫化物连接的二聚体，在形状上类似捕蝇草。在过去的几年中，已解析一些家族AGPCR的结构，并通过开发一些关键技术已实现这些里程碑。一种这样的技术是将T4溶菌酶(T4L)插入在细胞内的细胞质环(ICL)3中，并认为这样将生成允许形成晶体接触的大亲水区域[2][3]。这种技术与脂立方相结晶学相结合的应用已允许Beta2、A2a、CXCR4和D3受体的高分辨率结构确定[2]。因此，已从这些关于家族A受体的TM束的定位和组织的结构中搜集到重要的信息。然而，几乎没有信息可用于家族B和C受体的成员，而且考虑到高度的序列分歧，在这些家族间的TM结构域的结构和组织上可能存在显著的不同[1]。在家族A受体中，因为认为螺旋5和6之间的距离与T4L的N和C端之间的距离接近，所以将T4L插入到ICL3中。因此，可能在这个位置容纳融合蛋白，而不认为其它螺旋之间的距离有助于插入融合配偶体。事实上，已将T4L与一些不同的家族A受体在ICL3上相融合，在每种情况下功能蛋白都得以表达并具有受体柔性减少的额外优点，并因此增加整体稳定性。我们检测了将T4L插入在家族B受体的内环、特别在ICL3中的效果。我们的数据表明家族B受体不能在ICL3中容纳T4L融合，然而令人惊讶和意想不到的是，考虑到家族A受体的结构，将T4L加入ICL2中改善了家族B受体的生物化学性质。ICL2将GPCR包含跨膜螺旋(TM)-1、TM2和TM3的部分连接到GPCR包含TM4、TM5、TM6和TM7的部分。目前的数据表明，与家族A受体不同，在家族B受体中，螺旋3和4之间的距离与T4L的N和C端之间的距离更接近，而不是螺旋5与6之间的距离与T4L的N和C端之间的距离更接近。因此，认为在GPCR的这两个部分之间插入稳定的蛋白结构域代表了之前未能预测到的促进GPCR结晶的新技术。
技术实现思路
因此，本专利技术的第一方面提供融合蛋白，其从N端到C端包含：a)家族B的G蛋白偶联受体(GPCR)的第一部分，其包含GPCR的TM1、TM2和TM3；b)稳定的蛋白结构域；以及c)GPCR的第二部分，其包含GPCR的TM4、TM5、TM6和TM7。我们以“GPCR”表示具有GPCR信号活性且保留完整7个TM区的G蛋白偶联受体或多肽。本领域标准命名法将GPCR的跨膜螺旋从N端至C端命名为TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6和TM7。跨膜螺旋通过在TM2和TM3之间、在TM4和TM5之间、在TM6和TM7之间的细胞外氨基酸延伸连接，分别称为细胞外环(ECL)1、2和3。跨膜螺旋通过在TM1和TM2之间、在TM3和TM4之间以及在TM5和TM6之间的细胞内氨基酸延伸连接，分别称为细胞内环(ICL)1、2和3。因此，如上定义的第一和第二GPCR部分通过ICL2区天然地连接，即ICL2将连接至ICL2N端的第一部分(包含TM1、TM2和TM3)与连接到ICL2C端的第二部分(包含TM4、TM5、TM6和TM7)连接。GPCR优选地源自包含天然多态性的全长野生型序列，或源自被改变的突变体GPCR分子，例如为改善所述GPCR的一个或多个性质如稳定性而已将GPCR分子改变。GPCR可源自野生型和突变体GPCR，其中所述突变体GPCR可以是偏向特定构象，例如激动剂或拮抗剂的稳定的GPCR。例如，随后可将稳定的蛋白结构域插入在构象上稳定的GPCR的TM3和TM4之间。我们之前已经开发了在生物学相关构象中稳定GPCR的方法(参见WO2008/114020)，其描述了称为StaRsTM的稳定GPCR生产，当从细胞膜中纯化时，所述方法能够纯化保持其构象、稳定性和功能的重组G蛋白偶联受体。此外，这种平台技术也提供将偏向激动剂构象或拮抗剂构象的受体进行工程化的方法(也参见Magnani等，2008；Serrano-Vega等，2008；Shibata等，2009)，即其在特定构象中具有增加的稳定性。这种稳定的受体可用于本专利技术并具有一些优势，例如稳定性、提高纯化蛋白产量、减少变性和减少非特异性结合。在本专利技术中使用稳定的突变体GPCR时，优选地选择和制备使用任何在PCT申请WO2008/114020、WO2009/114020和WO2009/081136中所述的方法。优选地，第一和第二GPCR部分来自于在特定构象中、相对于亲代GPCR具有增加稳定性的GPCR(即增加的构象稳定性)。通过增加构象的稳定性，我们包括如下含义：当暴露在变性剂或变性条件中，与相同构象的亲代GPCR相比特定构象的突变体GPCR具有增加的稳定性(例如延长的寿命)。变性剂/变性条件的实例包括热、去污剂、离液剂和极端pH。如本领域所公知，这样的变性剂或变性条件可影响蛋白的二级和三级结构而不是一级序列。在本专利技术实施中适合使用的GPCR包括任何家族B的GPCR，例如类胰高血糖素肽1受体(GLP1R)、类胰高血糖素肽2受体(GLP2R)、降钙素受体(CT)、糊精/CGRP受体(AMY1α)、糊精受体(AMY2α)、糊精/CGRP受体(AMY3α)、CGRP/肾上腺髓质素受体(CGRP1α)、肾上腺髓质素/CGRP受体(AM1α)、肾上腺髓质素/CGRP受体(AM2α受体)、促肾上腺皮质激素释放因子受体(CRF1)、尿皮质素本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其从N端至C端包含：a)家族B的G蛋白偶联受体的第一部分，其包含G蛋白偶联受体的跨膜螺旋TM1、TM2和TM3；b)稳定的蛋白结构域；以及c)G蛋白偶联受体的第二部分，其包含G蛋白偶联受体的TM4、TM5、TM6和TM7。
【技术特征摘要】
2011.08.10 US 61/522,1471.一种融合蛋白，其从N端至C端包含：a)家族B的G蛋白偶联受体的第一部分，其包含G蛋白偶联受体的跨膜螺旋TM1、TM2和TM3；b)稳定的蛋白结构域；以及c)G蛋白偶联受体的第二部分，其包含G蛋白偶联受体的TM4、TM5、TM6和TM7。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述G蛋白偶联受体是家族B的G蛋白偶联受体；优选地，所述家族B的G蛋白偶联受体选自：类胰高血糖素肽1受体、类胰高血糖素肽2受体、降钙素受体、糊精/CGRP受体AMY1α、糊精受体AMY2α、糊精/CGRP受体AMY3α、CGRP/肾上腺髓质素受体CGRP1α、肾上腺髓质素/CGRP受体AM1α、肾上腺髓质素/CGRP受体AM2α、促肾上腺皮质素释放因子受体CRF1、尿皮质素受体CRF2、生长激素释放激素受体、抑胃多肽受体、胰高血糖素受体、分泌素受体、TIP-39受体PTH2、甲状旁腺激素受体PTH1、VIP/PACAP受体VPAC1、PACAP受体PAC2以及VIP/PACAP受体VPAC2中的任一项。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述G蛋白偶联受体是相对其亲代G蛋白偶联受体具有增加的构象稳定性的突变体G蛋白偶联受体。4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述稳定的蛋白结构域插入至G蛋白偶联受体的细胞内环2区，其中所述的环连接G蛋白偶联受体的第一和第二部分。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中根据图6所示人GLP1R的编号，在与氨基酸Phe257和Ser261相对应的氨基酸残基之间的位置上，将稳定的蛋白结构域插入至所述G蛋白偶联受体的细胞内环2区。6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中根据图6所示人GLP1R的编号，在与氨基酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·A·亚扎耶尔徳兹浮力，F·H·马歇尔，
申请(专利权)人：赫普泰雅治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB
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