一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽及其制备方法和应用。化学合成低pH插入肽(pHLIP)和Beclin 1活性片段的基因序列，通过限制性酶切位点将该序列连接到pET‑32a表达载体上，获得重组质粒。将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得工程菌pET‑32a‑pHLIP‑Beclin 1/BL21(DE3)。该工程菌经IPTG诱导表达，收集菌体，分离纯化获得目的蛋白。本发明专利技术的肿瘤酸度响应自噬诱导多肽能够通过pHLIP定位至肿瘤酸性微环境，将Beclin 1活性片段靶向输送到肿瘤细胞中，从而诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡，可在制备靶向抗癌药物中应用。

A tumor acidity responsive autophagy induced polypeptide and its preparation and Application

The present invention provides a tumor acidity responsive autophagy induced polypeptide and a preparation method and application. The chemical synthesis of low pH peptide (pHLIP) gene insertion sequence and Beclin 1 active fragments, using restriction endonuclease sites of the sequence is connected to the pET 32A expression vector, recombinant plasmid. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), pET 32A engineering bacteria pHLIP Beclin 1/BL21 screening (DE3). The engineered bacteria were induced and expressed by IPTG, and the bacteria were collected and purified to obtain the target protein. The invention of the tumor acidity autophagy induced by peptides can through the pHLIP to the tumor acidic microenvironment, Beclin 1 active fragment targeted delivery to cancer cells, thus inducing autophagic cell death in tumor cells, in the preparation of application of targeted anticancer drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物技术制药领域，具体涉及一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽及其制备方法和该多肽在制备靶向抗癌药物中的应用。
技术介绍
Beclin1通过对自噬的调节，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。目前，Beclin1已被确定为一个新的抑癌基因。然而据报道：75％的卵巢癌、50％的乳腺癌和40％的前列腺癌中存在Beclin1基因的缺失性突变，Beclin1蛋白表达量下降，自噬功能降低。因此，若能增强这些肿瘤患者中Beclin1的表达，进而启动自噬过程，肿瘤细胞就会因为过度自噬而死亡，达到抑制肿瘤生长的目的。然而，Beclin1本身不能进入细胞，缺乏组织特异性而且体内稳定性差，这就大大限制了其在肿瘤治疗中的应用。快速增殖的肿瘤细胞具有异常的营养需求与代谢特征(Warburg效应)，使得肿瘤微环境具有一些独特的特征，可将几乎所有的恶性实体瘤与周围的正常组织区分开来。与健康组织相比(pH7.2-7.4)，肿瘤组织具有更低的细胞外pH(pH6.5-7.0)。酸中毒是肿瘤从早期向晚期进展的一个重要标志，可以为肿瘤检测和靶向治疗提供新的思路。肿瘤酸性微环境靶向不依赖于肿瘤组织的病理生理学特征及生物标志物，可以弥补主动靶向与被动靶向方式存在的不足。低pH插入肽(pHlowinsertionpeptide,pHLIP)是来源于细菌视紫红质C螺旋的一种水溶性多肽，由36个氨基酸组成，其在酸性条件下可通过形成稳定的跨膜α螺旋将C端插入细胞膜中。因此，pHLIP可作为肿瘤酸性微环境靶向输送载体将目的药物或基因递送至肿瘤细胞内。专利技术内容本专利技术的目的在于提出一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽及其制备方法和该多肽在制备靶向抗癌药物中的应用。本专利技术的肿瘤酸度响应自噬诱导多肽从N端到C端依次包含：pET-32a表达载体上标签蛋白Trx氨基酸序列、肿瘤酸度响应靶向分子pHLIP序列和自噬起始因子Beclin1活性片段的氨基酸序列。本专利技术提供一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽，其氨基酸序列为SDQIDNO：1，由221个氨基酸组成。编码所述肿瘤酸度响应自噬诱导多肽的基因，其核苷酸序列为SDQIDNO：2，由672个核苷酸组成。一种载体，含有上述所述的核苷酸序列。它是将编码pHLIP-Beclin1的核苷酸片段克隆至原核表达载体后获得的重组质粒pET-32a-Trx-pHLIP-Beclin1。所述载体是一种质粒。一种工程菌，含有上述所述载体。是将重组质粒pET-32a-Trx-pHLIP-Beclin1转化至一种菌，例如大肠杆菌BL21(DE3)中，构建成工程菌pET-32a-Trx-pHLIP-Beclin1/BL21(DE3)。一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽的制备方法，包括如下步骤：化学合成pHLIP和Beclin1活性片段的基因序列，通过限制性酶切位点将其连接到pET-32a表达载体上，获得重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选获得工程菌pET-32a-Trx-pHLIP-Beclin1/BL21(DE3)。将该工程菌接种到含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养至A600nm为0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mM，16℃过夜诱导，收集菌体，超声破碎离心收集上清，经亲和层析纯化获得目的蛋白。肿瘤酸度响应自噬诱导多肽在制备抗癌药物中的应用。选用人乳腺癌细胞系MCF-7通过结晶紫染色法、Ad-mCherry-GFP-LC3B和WesternBlot等手段来验证目的蛋白Trx-pHLIP-Beclin1的生物学活性，实验结果表明：在弱酸性(pH＝6.5)条件下，Trx-pHLIP-Beclin1可显著抑制MCF-7的生长和增殖，其抗肿瘤活性显著优于单独的Beclin1活性片段。WesternBlot检测自噬相关蛋白p62、LC3I及LC3II表达水平的变化，结果显示使用Trx-pHLIP-Beclin1处理细胞后p62含量显著降低、LC3II含量显著增加，表明Trx-pHLIP-Beclin1可诱导肿瘤细胞发生自噬。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术提供的肿瘤酸度响应自噬诱导多肽具有制备简便、产率高、抗肿瘤活性强等优点。该多肽可通过大肠杆菌原核表达快速获得，产率可达21.8mg/L，在弱酸性条件下其抗肿瘤活性显著优于单独的Beclin1活性片段，因此可在制备靶向抗癌药物中应用。附图说明图1pHLIP-Beclin1目的基因PCR扩增图(泳道1为标准分子量，泳道2是目的基因)图2pET-32a-Trx-pHLIP-Beclin1重组质粒阳性克隆鉴定图(泳道1为标准分子量，泳道2至10为目的基因)图312％SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测目的蛋白和标签蛋白表达结果。(M：标准分子量；泳道1表示含有空质粒菌体在16℃条件下经1mMIPTG过夜诱导，超声破碎后，离心得到的上清蛋白样；泳道2、3和4表示含有重组质粒菌体在16℃条件下经1mMIPTG过夜诱导，超声破碎后得到的全菌蛋白样品和离心得到的上清和沉淀蛋白样品；泳道5表示未经诱导的菌体经超声破碎后，离心得到的上清蛋白样品)图412％SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测目的蛋白和标签蛋白表达纯化结果(M：标准分子量；泳道1、2分别为标签蛋白纯化前后蛋白样；泳道3、4分别为融合蛋白纯化前后蛋白样)图5结晶紫法研究不同浓度融合蛋白对肿瘤细胞生长抑制结果及统计图(图中A表示在pH＝7.4/6.5条件下使用10μM融合蛋白处理MCF-7细胞24h经结晶紫染色后，细胞增殖情况。图中B表示在pH＝7.4条件下使用10μM融合蛋白处理MCF-7细胞24h经结晶紫染色后，甲醇溶解使用酶标仪测定吸光值。图中C表示在pH＝6.5条件下使用10μM融合蛋白处理MCF-7细胞24h经结晶紫染色后，甲醇溶解使用酶标仪测定吸光值)图6WesternBlot法检测融合蛋白处理MCF-7细胞后自噬标记蛋白LC3II及p62蛋白表达水平(图中A表示在pH＝7.4/6.5条件下使用10μM融合蛋白处理MCF-7细胞24h后，用westernblot法检测p62、LC3I和LC3II蛋白表达水平。图中B来源于图中A的LC3-II/LC3-I和p62/GAPDH灰度值分析结果)图7Ad-mCherry-GFP-LC3B法观察自噬体数量及统计图(图中A表示在pH＝7.4条件下使用10μM融合蛋白处理MCF-7细胞24h后，通过荧光斑点数判定自噬情况。图中B表示在pH＝6.5条件下使用10μM融合蛋白处理MCF-7细胞24h后，通过荧光斑点数判定自噬情况。图中C来源于对图中A和B的荧光斑点数统计结果。具体实施方式实施例1：融合蛋白质粒的构建化学合成pHLIP-Beclin1基因序列GGATCCGCGGCGGAACAGAACCCGATTTATTGGGCGCGCTATGCGGATTGGCTGTTTACCACCCCGCTGCTGCTGCTGGATCTGGCGCTGCTGGTGGATGCGGATGAAGGCACCTGCGGCACCAACGTGTTTAACGCGACCTTTCATATTTGGCATAGCGGCCAGTTTGGCACCTAACTCGAG，并在该目的蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽，其特征在于从N端到C端依次包含：pET‑32a表达载体上标签蛋白Trx氨基酸序列、肿瘤酸度响应靶向分子pHLIP序列和自噬起始因子Beclin 1活性片段的氨基酸序列；其氨基酸序列为SDQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽，其特征在于从N端到C端依次包含：pET-32a表达载体上标签蛋白Trx氨基酸序列、肿瘤酸度响应靶向分子pHLIP序列和自噬起始因子Beclin1活性片段的氨基酸序列；其氨基酸序列为SDQIDNO：1。2.编码权利要求1所述肿瘤酸度响应自噬诱导多肽的基因，其核苷酸序列为SDQIDNO：2。3.一种载体，含有权利要求2所述的核苷酸序列。4.一种工程菌，含有权利要求3所述的载体。5.如权利要求1所述的肿瘤酸度响应自噬诱导多肽的制备方法，主要包括以下步骤：化学合成pHLIP和Beclin1活...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁国斌，李卓玉，孙俊清，杨鹏，李彬春，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14