一种稳定蛋白质C或活性蛋白质C的方法以及由此所得的稳定化组合物技术

一种稳定蛋白质Ｃ或活性蛋白质Ｃ的方法，其包括添加至少一种氨基酸，及清蛋白和非离子型表面活性剂两者之一或两者的组分到含有蛋白质Ｃ或活性蛋白质Ｃ及钠离子的盐缓冲剂中。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种稳定从血浆中得到或通过基团重排技术制备的蛋白质C或活性蛋白质C的方法。更为具体的是，本专利技术涉及一种在其被贮存或已经过分离和纯化、冷冻干燥、加热等处理时，稳定蛋白质C或活性蛋白质C的方法，本专利技术也涉及一种由此法稳定的制剂。
技术介绍
蛋白质C(在下文中也称为“PC”)是一种维生素K相关蛋白质，即一种含有γ-羧基谷氨酸的蛋白质，其可在存在于脉管内皮细胞表面上的thrombomodulin存在下，通过凝血酶被活化成活性蛋白质C(在下文中也称为“APC”)。活性蛋白质C是一种丝氨酸蛋白质酶，有很强的抗凝聚活性，其是通过使血液凝聚的辅因子失活来完成的，这些辅因子如Va因子(FVa)和VIIIa因子(FVIIIa)。已知活性蛋白质C从血管壁释放一种血纤维蛋白溶酶原的活化物以加速血纤维蛋白溶解过程，而且，已知蛋白质C的一个缺点是引起严重的凝血作用。因此，活性蛋白质C是调节血血液凝聚和溶解作用的最重要因素。因此，希望开发利用蛋白质C或活性蛋白质C作为一种新的抗凝血剂或血纤维蛋白溶酶原试剂。到目前为止，已知血浆中或通过人工组织培养得到的蛋白质C的量是很低的。因此，为了更安全和更广泛地把蛋白质C或活性蛋白质C作为一种抗凝血剂或血纤维蛋白溶酶原试剂，分离和纯化蛋白质C或活性蛋白质C是很重要的。另外，工业上大规模制备蛋白质C或活性蛋白质C，以溶液或冷冻的方式长期贮存时，冷冻干燥或使感染性病毒失活如加热等过程是必不可少的。然而，贮存放置、冷冻或冷冻干燥、或加热处理高纯蛋白质C或活性蛋白质C都很大程度地降低它的活性。也没有见到关于经高度提纯蛋白质C或活性蛋白质C稳定性的报导。在这些情况下，工业规模上稳定和有效地提供高纯度蛋白质C或活性蛋白质C是不可能的。在这种情况下，本专利技术人认真地研究了蛋白质C或活性蛋白质C的稳定性，结果表明蛋白质C或活性蛋白质C的活性通过下述方法能够保持住，即使是贮存放置相当长时间或经过了分离和纯化、冷冻干燥、加热等过程。该方法是向蛋白质C或活性蛋白质C中添加至少一种氨基酸到一种含钠离子的磷酸或柠檬酸的缓冲剂中，而后添加清蛋白和非离子型表面活性剂中的一种或两者结合，这样就完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术涉及一种稳定蛋白质C或活性蛋白质C的方法，其包括添加至少一种氨基酸到含有蛋白质C或活性蛋白质C及钠离子的缓冲液中，而后加清蛋白和非离子型表面活性剂中的一种或两者结合于前溶液中。更为具体的是，本专利技术涉及稳定蛋白质C或活性蛋白质C的方法，其中包括将蛋白质C或活性蛋白质C溶于如含钠离子的磷酸或柠檬酸缓冲溶液中，而后加至少一种构成蛋白质的氨基酸于上述溶液中，这些氨基酸例如可以是甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等等，还要加入具有稳定蛋白质活性作用的多肽如清蛋白、球蛋白等，在优选的实施方案中，也可加入任选的非离子型表面活性剂，一般为Tween80。本专利技术也涉及到由此法稳定的制剂。实施本专利技术的最佳方案本文中使用的蛋白质C或活性蛋白质C包括各种有较大的APC活性的化合物及其衍生物，它们可以由已知的办法制备。例如，从人体血浆中直接分离出蛋白质C或利用基因重组技术制备得到蛋白质C，然后使蛋白质C活化；直接从人体血浆中分离出APC；或用基因重组技术制备APC等等。可以用已知的办法把蛋白质C活化为活性蛋白质C，例如，可以用从人或牛的血液中分离出的凝血酶活化，或用同类的蛋白酶活化等等。从血液中制备APC可采用例如下列方法通过亲合色谱法，用抗蛋白质C抗体从人的血浆中纯化得到蛋白质C，再用人体凝血酶活化，并且用阳离子色谱法纯化得到的活性蛋白质C(Blood，63，P.115-121(1984))；或按照Kisiel描述的方法，激活从人体血浆中纯化得到的蛋白质C以产生APC(J.Clin.Invest.，64，p.761-769(1979))，其中采用柠檬酸钠吸附和洗脱，用硫酸铵分馏，二乙基氨基乙醇-交联葡萄糖(DEAE-Sephadex)的柱色谱法，葡聚糖硫酸琼脂糖色谱法和聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法纯化蛋白质C，或按照Taylor等人所述的方法(J.Clin，Invest.，79，P.918-925(1987))激活一种商业上可得的含蛋白质C的血液凝聚剂而得到活性蛋白质C。用基因重组技术得到APC产物可以如下列日本专利所描述的方法制备日本专利首次公布号(Kokai)NO.61-205487；(Kokai)NO.1-2338；(kokai)No 1-85084等等。本文所用的起始原料蛋白质C或活性蛋白质C的制备过程，并不仅限于上文所提到的过程。因此，制备的起始原料蛋白质C或活性蛋白质C的纯化和分离过程，是将生物化学上常用的各种分离和纯化过程结合起来使用的，包括如用硫酸铵的盐析法，用离子交换树脂的离子交换色谱法、凝胶过滤、电泳等等。当用这些方法不断提高蛋白质C或活性蛋白质C的纯度时，它必定变得不稳定。当产物经过了贮存放置、冷冻、冷冻干燥、加热等过程处理时，即使没有很高的纯度，它的活性也会降低。本专利技术的主要目的是研究如何稳定这些由于纯度不断提高而变得不稳定的蛋白质C或活性蛋白质C。由本专利技术得到的蛋白质C或活性蛋白质C可以是液体或者粉末状。本专利技术的稳定蛋白质C或活性蛋白质C的方法中，将含作为稳定剂的浓度最好为50mM-200mM的钠离子的盐，至少一种氨基酸和一种有稳定作用的多肽加到含有100-2500U/ml的蛋白质C或活性蛋白质C的缓冲溶液中。盐和氨基酸可单独使用或两种及多种结合使用。优选的缓冲剂如柠檬酸钠、磷酸钠和硫酸钠等。加入的氨基酸的最后浓度为0.005M-0.1M，最好为0.01M-0.05M。有稳定作用的多肽如清蛋白或球蛋白的适当浓度取决于一般常识或节约观点，优选浓度为0.5％(w/v)-10％(w/v)。单位“％(w/v)”此处表示一定量的溶质溶解在1升溶液中，例如，当10g溶质溶在1升溶液里，浓度为1％(w/v)。在本专利技术的优选方案里，加入任选的一种非离子型表面活性剂如Tween 80以提高稳定效果，其浓度为0.0005％(w/v)-0.1％(w/v)。本专利技术的一个典型实施方案是含有蛋白质C或活性蛋白质C的缓冲水溶液，其含有100-2500U/ml的蛋白质C和/或活性蛋白质C，50-200mM的钠离子，5-100mM的氨基酸，还含有0.5-10％(w/v)的清蛋白及0.0005-0.1％(w/v)的非离子型表面活性剂两者之一或两者的组合。当加入到蛋白质C或活性蛋白质C的稳定剂是粉末时，使用的量是当粉末溶解时其浓度在上述提到的浓度范围内。因此，本专利技术的另一典型方案是含有蛋白质C或活性蛋白质C的组合物，其包括1×105-2.5×106U的蛋白质C和/或活性蛋白质C，50-200mg的钠离子，5-100mM的一种氨基酸，还含5-100g的清蛋白及0.005-1g的非离子型表面活性剂两者之一或两者的组合。加入这些成分的方法不是特定的，其包括各种方法。例如直接将本专利技术的粉末物质加入到含有蛋白质C或活性蛋白质C的缓冲剂中；或先将上述的粉末材料溶于水中或一适当缓冲剂中，然后加溶液于含蛋白质C或活性蛋白质C的缓冲溶液中；或将含蛋白质C或活性蛋白质C的粉末与上述粉末物质混合。也可以在分离和纯化蛋白质的过程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宫田和正，秋本芳则，绪方洋一，中垣智弘，
申请(专利权)人：财团法人化学及血清疗法研究所，帝人株式会社，
类型：发明
国别省市：