MG7，高度糖基化CEA特异性结合的单链抗体及其在检测和治疗上的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种糖基化CEA特异性单链抗体，以及一种靶向糖基化CEA的嵌合抗原受体(CAR)，可用于制备诊断或治疗过表达糖基化CEA的肿瘤的试剂或药物。

MG7, a highly glycosylated CEA specific binding single chain antibody and its application in detection and treatment

The invention provides a glycosylated CEA specific single chain antibody, and a chimeric antigen receptor (CAR) targeting glycosylated CEA, which can be used for preparing diagnostic agents or drugs for overexpressing glycosylated CEA tumors.

【技术实现步骤摘要】
MG7，高度糖基化CEA特异性结合的单链抗体及其在检测和治疗上的应用
本专利技术涉及到肿瘤免疫治疗领域，更具体的，本专利技术涉及糖基化CEA特异性单链抗体，以及对过表达糖基化CEA的肿瘤的转基因修饰的过继T淋巴细胞治疗领域。
技术介绍
胃癌的发病率在我国居消化道恶性肿瘤之首，在世界上居第二位，年死亡数约占恶性肿瘤死亡人数的24％，五年生存率仅约为27％。胃癌患者的诊断发现往往已到晚期，因此预后极差。针对胃癌并无有效的靶向治疗药物。CEA(carcinoembryonicantigen)癌胚抗原，是一种膜结合蛋白，一般在胎儿肝肠胰等组织表达。正常分泌入肠道，血清中含量很少。细胞癌变时，血清中水平升高，对胰腺癌、结肠癌早期诊断有辅助意义，对肿瘤的扩散、疗效、复发和预后有一定的参考价值。第四军医大学樊代明教授发现糖基化的CEA对多种消化道癌的敏感性特异性都很高。临床研究表明，糖基化CEA在胃癌组织中的阳性率在80％以上，在结肠癌组织中阳性率在40％以上，在胃癌前病变阳性率在30％以上，在食道癌组织中阳性率在18％以上。同时临床实验结果显示，28例胃癌患者术后血清中糖基化CEA的阳性率比术前明显下，提示糖基化CEA与胃癌发病存在着密切关系(Gadleretal.,IntJCancer25(1):91-4，1980)。目前，新兴的具有靶向性过继细胞治疗技术嵌合抗原受体T淋巴细胞(ChimericantigenreceptorTcell，CAR-T)在多种恶性肿瘤治疗中均发挥着重要作用，CAR-T是将如单链抗体、特异性受体等针对肿瘤相关抗原(TAA)特异性识别肽段与T细胞激活信号如CD3zeta融合偶联，并通过如慢病毒等方式将该融合蛋白特异性表达于T细胞表面，使修饰过的T细胞可以对肿瘤细胞进行特异性识别并杀伤，且不依赖于主要组织相容性抗原(MHC)，避免了由于MHC缺失导致的肿瘤免疫逃逸。嵌合抗原受体包括胞外靶向识别抗原区、铰链区、跨膜区及胞内共刺激信号区。抗原识别区多为单链抗体或者特异性受体，保证修饰的T细胞可以特异性的识别靶细胞，并被激活，对靶细胞产生特异性杀伤作用；铰链区一般采用如CD8α、CD28ECD、IgGFc片段等，保证T细胞与靶细胞接触距离，影响到T细胞作用；胞内信号区域采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，如CD3zeta及共刺激信号如CD28、CD137、CD27、ICOS、OX40、DAP10等(Sadelainetal.,CancerDiscov3(4):388-98，2013)。尽管在恶性血液病的治疗中，CAR-T展现出了良好的应用价值，但在实体瘤治疗中，CAR-T往往并不能达到预期效果，甚至在临床研究中，CAR-T可能会存在由于脱靶效应而产生的毒性。其重要原因为，在实体瘤中往往没有一个有效的、特异性强的靶点。对于众多肿瘤相关抗原中，往往在正常组织也有一定程度的表达，如HER2为恶性胶质瘤、乳腺癌等恶性肿瘤的重要靶点，在针对HER2靶点的CAR-T临床实验中，患者在回输CAR-T后出现肺部衰竭，并引发“细胞因子风暴”导致患者在短时间内死亡。因此在实体瘤中找到一个高特异性和高灵敏度的靶点是CAR-T治疗方法在实体瘤中应用的关键点(Morganetal.,MolTher18(4):843-51，2010)。NK细胞是表达CD16和CD56的淋巴细胞并且是天然免疫中重要的组成部分，NK细胞可以杀死MHC缺失的靶细胞，与T细胞相比NK细胞不表达T细胞受体因而不会发生移植物抗宿主反应(GVHD)。NK细胞激活处于激活性受体(KAR，KillerActivationReceptor)和抑制性受体(KIR，KillerInhibitionReceptor)信号的平衡状态，体内主要的KIR配体为MHC，对于错配或缺失KIR配体，会造成NK细胞的激活；CAR-NK技术是利用CAR结构表达在NK细胞或NK细胞系(例如NK92)表面从而用于治疗癌症的新兴技术，其优点为NK细胞不分泌IL6、NK细胞在外周血中循环半衰期很短、NK细胞转染效率高(非病毒载体)、NK细胞系可以大规模培养GMP级别；将CAR结构表达在NK细胞或NK细胞系表面可以使NK细胞获得靶向性，同时在CAR-NK异体移植中，由于KIR受体的错配，因此会增强NK细胞的激活从而达到更好的肿瘤消除效果；NK细胞系在体内的循环时间很短，因此提供了安全性考虑(Hanetal.,SciRep5:11483,2015)。
技术实现思路
在第一个方面，本专利技术提供了嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包括:i)靶向糖基化CEA的抗原结合结构域；ii)跨膜结构域，和iii)细胞内信号传导结构域，其包含共刺激结构域，其中所述靶向糖基化CEA的抗原结合结构域包含一重链可变区及一轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区及轻链可变区选自以下任一组合：a.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:1所示的CDR-H1、由SEQIDNO:2所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:3所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:4所示的CDR-L1、由SEQIDNO:5所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:6所示的CDR-L3；b.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:7所示的CDR-H1、由SEQIDNO:8所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:9所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:10所示的CDR-L1、由SEQIDNO:11所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:12所示的CDR-L3；c.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:13所示的CDR-H1、由SEQIDNO:14所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:15所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:16所示的CDR-L1、由SEQIDNO:17所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:18所示的CDR-L3；d.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:19所示的CDR-H1、由SEQIDNO:20所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:21所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:22所示的CDR-L1、由SEQIDNO:23所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:24所示的CDR-L3；或e.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:25所示的CDR-H1、由SEQIDNO:26所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:27所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:28所示的CDR-L1、由SEQIDNO:29所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:30所示的CDR-L3。在一个具体实施方式中，所述重链可变区及轻链可变区选自以下任一组合：a)所述重链可变区包含由SEQIDNO:31所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQIDNO:32所示的多肽片段；b)所本文档来自技高网...

【技术保护点】
嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包括:i)靶向糖基化CEA的抗原结合结构域；ii)跨膜结构域，和iii)细胞内信号传导结构域，其包含共刺激结构域，其中所述靶向糖基化CEA的抗原结合结构域包含一重链可变区及一轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区及轻链可变区选自以下任一组合：a.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:1所示的CDR‑H1、由SEQ ID NO:2所示的CDR‑H2、或由SEQ ID NO:3所示的CDR‑H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:4所示的CDR‑L1、由SEQ ID NO:5所示的CDR‑L2、或由SEQ ID NO:6所示的CDR‑L3；b.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:7所示的CDR‑H1、由SEQ ID NO:8所示的CDR‑H2、或由SEQ ID NO:9所示的CDR‑H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:10所示的CDR‑L1、由SEQ ID NO:11所示的CDR‑L2、或由SEQ ID NO:12所示的CDR‑L3；c.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:13所示的CDR‑H1、由SEQ ID NO:14所示的CDR‑H2、或由SEQ ID NO:15所示的CDR‑H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:16所示的CDR‑L1、由SEQ ID NO:17所示的CDR‑L2、或由SEQ ID NO:18所示的CDR‑L3；d.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:19所示的CDR‑H1、由SEQ ID NO:20所示的CDR‑H2、或由SEQ ID NO:21所示的CDR‑H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:22所示的CDR‑L1、由SEQ ID NO:23所示的CDR‑L2、或由SEQ ID NO:24所示的CDR‑L3；或e.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:25所示的CDR‑H1、由SEQ ID NO:26所示的CDR‑H2、或由SEQ ID NO:27所示的CDR‑H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:28所示的CDR‑L1、由SEQ ID NO:29所示的CDR‑L2、或由SEQ ID NO:30所示的CDR‑L3。...

【技术特征摘要】
1.嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包括:i)靶向糖基化CEA的抗原结合结构域；ii)跨膜结构域，和iii)细胞内信号传导结构域，其包含共刺激结构域，其中所述靶向糖基化CEA的抗原结合结构域包含一重链可变区及一轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区及轻链可变区选自以下任一组合：a.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:1所示的CDR-H1、由SEQIDNO:2所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:3所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:4所示的CDR-L1、由SEQIDNO:5所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:6所示的CDR-L3；b.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:7所示的CDR-H1、由SEQIDNO:8所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:9所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:10所示的CDR-L1、由SEQIDNO:11所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:12所示的CDR-L3；c.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:13所示的CDR-H1、由SEQIDNO:14所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:15所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:16所示的CDR-L1、由SEQIDNO:17所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:18所示的CDR-L3；d.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:19所示的CDR-H1、由SEQIDNO:20所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:21所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:22所示的CDR-L1、由SEQIDNO:23所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:24所示的CDR-L3；或e.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:25所示的CDR-H1、由SEQIDNO:26所示的CDR-H2、或由SEQIDNO:27所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQIDNO:28所示的CDR-L1、由SEQIDNO:29所示的CDR-L2、或由SEQIDNO:30所示的CDR-L3。2.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述重链可变区及轻链可变区选自以下任一组合：a)所述重链可变区包含由SEQIDNO:31所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQIDNO:32所示的多肽片段；b)所述重链可变区包含由SEQIDNO:33所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQIDNO:34所示的多肽片段；c)所述重链可变区包含由SEQIDNO:35所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQIDNO:36所示的多肽片段；d)所述重链可变区包含由SEQIDNO:37所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQIDNO:38所示的多肽片段；或e)所述重链可变区包含由SEQIDNO:39所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQIDNO:40所示的多肽片段。3.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域是特异性识别人糖基化CEA的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:171-180任一项所示，最优选地，所述单链抗体的氨基酸序列是SEQIDNO:173或SEQIDNO:178。4.权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域包括CD8α和/或CD28，所述细胞内信号传导结构域包含CD28，CD137，和CD3zeta中的一种或多种，其中优选地，CD8α铰链区由SEQIDNO:52所示序列编码，CD8α跨膜区由SEQIDNO:54所示序列编码，CD28铰链区由SEQIDNO:53所示序列编码，CD28跨膜区由SEQIDNO:55...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊代明，聂勇战，吴开春，曹跃琼，袁纪军，余学军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，上海吉凯基因化学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61