CK‑MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种CK‑MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒，该融合蛋白由CK‑M蛋白和CK‑B蛋白通过Loop连接形成，与天然CK‑MB蛋白功能相同。其制备方法是将人源性CK‑M和CK‑B的编码基因序列用Loop的核苷酸碱基偶联在一起，克隆到表达载体得到表达质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，培养产物经过细菌超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Superdex G200分子筛层析柱，得到活性蛋白含量高达85％的高纯度蛋白。本发明专利技术采用稀土荧光微球作为标记载体制备了测CK‑MB的试剂盒，具有稳定、敏感、定量、简便、快速、结果可靠的特点。

【技术实现步骤摘要】
CK-MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒
本专利技术涉及CK-MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒。具体是一种新型肌酸激酶MB型(CK-MB)标准品的基因工程表达及其时间分辨荧光定量检测试剂盒。
技术介绍
肌酸激酶(CreatineKinase,CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。肌肉型肌酸激酶分子是由两个相同的亚基组成的二聚体。CK-MB在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中CK-MB水平迅速提高，目前认为在心肌梗塞的诊断中测定CK-MB的活性比做心电图更为可靠。心肌梗塞时，肌酸激酶在起病6小时内升高，24小时达高峰，3～4日内恢复正常。且CK-MB诊断的特异性最高。CK-MB因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。现阶段，临床上CK-MB的检测方法有双抗夹心免疫化学发光法、放射性免疫法、酶联免疫法(ELISA)、免疫层析法等。双抗夹心免疫化学发光法具有敏感度高、所需时间短等优点，但是不能检测正常人血中的CK-MB。放射性免疫法是通过将放射活性分子共价交联至CK-MB抗体免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来间接定量检测CK-MB的一种超微量分析方法。具有特异性好、灵敏度高(可达ng和pg级)、操作简便、样品制备简单、精确定量等优点，但是该方法中操作人员会接触到放射性物质，可能会损害操作人员的身体，而且检测完成后怎样处置放射性材料也是个严重的问题。CK-MB的酶联免疫检测方法是双抗夹心ELISA方法，将一对CK-MB单抗分别进行酶标板固化和酶标记，抗原抗体反应后，通过酶与底物的呈色反应，即可显示特定抗原是否存在，并可根据呈色之深浅进行定量分析。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、样品能量大、不但能进行定性检测也能定量检测，但是耗时较长。侧向层析法在疾病快速诊断、小分子快速检测等领域已得到了广泛的应用。其原理是将特异性的抗原或抗体包被到硝酸纤维素膜上，构成检测线，将二抗包被在距离检测线在2～3毫米的区域构成质控线。当样本中的目标分子与带有特定标记物的检测抗体结合后，从硝酸纤维素膜的上样端向吸水端层析。由于毛细管作用，复合物将沿着膜向前移动，但移动到检测线时，样品中的目标分子将被检测线中的捕获抗体捕捉而停留在检测线，多余的检测抗体则通过检测线后被质控线的二抗所捕捉。常用的标记物为胶体金颗粒、荧光微球等。CK-MB的胶体金免疫层析法通过静电吸附将CK-MB抗体标记到胶体金颗粒表面，通过观察胶体金颗粒在检测线上的聚集显色判断检测结果。具有快速、简便、直观等优点，但同时存在着依靠肉眼识别、灵敏度低、无法精确定量、标记通过静电吸附，标记产物不稳定等缺点。CK-MB的免疫荧光层析技术是将CK-MB抗体共价结合于荧光微球表面的活性基团(-COOH、-NH2)上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断检测结果，延续了胶体金免疫层析方法的优势，同时具有高敏感度、完全定量、标记物稳定的优点。在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术,是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体,因镧系稀土离子Stokes位移大，避免了激发光和发射光的重叠而影响结果，而且镧系稀土离子荧光寿命长，，可以通过延长检测时间来消除检测物质本底荧光的干扰，提高了灵敏度，另外稀土元素的荧光强度高，同样能够提高检测的灵敏度。常用的稀土荧光微球为铕(EU)荧光微球。目前对于CK-MB的多种检测方法中，需用到大量高质量的标准品，由于人CK-MB天然来源有限，所以通过基因工程的方法来制备高质量重组CK-MB标准品(或免疫原)是CK-MB的主要来源。现有技术中对重组CK-MB的制备是通过克隆CK-M、CK-B基因，将二者的扩增产物分别连接至载体pEASY-Blunt构建转化质粒，再转化感受态Trans-TOP-1，用氨苄西林筛选平板筛选阳性菌落，回收CK-M、CK-B片段后转至质粒pGEX-4T-1，鉴定正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB转化感受态E.coliBL21(DE3)，以含Amp的LB培养基筛选培养，IPTG诱导表达。纯化采用GST亲和层析。这种方法操作过程较为繁琐，而且更重要的一点是所获得的重组蛋白多以包涵体形式存在，活性较差，实际应用中存在困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与天然CK-MB具有相同功能的融合蛋白，以弥补CK-MB天然来源有限的问题。本专利技术的另一个目的是针对现有基因工程方法制备CK-MB重组蛋白包涵体多、活性差的问题，提供一种能够获得高活性CK-MB重组蛋白的方法。本专利技术的再一目的是提供上述CK-MB融合蛋白在作为阳性对照品制备检测CK-MB的试剂盒中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：本专利技术提供的一种CK-MB融合蛋白，由CK-M蛋白和CK-B蛋白通过Loop连接形成，所述Loop的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。Loop连接CK-M蛋白和CK-B蛋白，形成二聚体蛋白产物，保持两个蛋白各自的空间结构，活性极高，与天然CK-MB功能相同。优选地，上述CK-MB融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还保护上述CK-MB融合蛋白的编码基因。本专利技术提供的一种上述CK-MB融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：将人源性CK-M蛋白和CK-B蛋白的编码基因序列用Loop的核苷酸碱基偶联在一起，克隆到表达载体pET28a的多克隆位点BamHI/XhoI中，得到表达质粒pET28a-CKMB；将表达质粒pET28a-CKMB转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达；培养结束后培养液用Tris-盐酸缓冲液搅拌振荡使细菌沉淀重悬，超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱和SuperdexG200分子筛层析柱，得到纯化的CK-MB蛋白。镍柱也称为镍离子亲和层析柱，是以琼脂糖凝胶微球为基础，在其表面共价交联带有多个游离羧基的配体有机小分子化合物，由于多个羧基与Ni2+发生螯合，螯合后的Ni2+能与目标蛋白中His上的咪唑环发生特殊的相互作用，从而实现蛋白质的分离。优选使用美国GE公司HisTrapHPNiFFNTA型号的5mL规格的镍离子亲和层析柱。强阴离子交换柱Q柱，优选使用美国GE公司HiTrapQ型号的5mL规格的预装柱。SuperdexG200凝胶过滤层析柱是美国GE公司Superd本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CK‑MB融合蛋白，其特征在于，由CK‑M蛋白和CK‑B蛋白通过Loop连接形成，所述Loop的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种CK-MB融合蛋白，其特征在于，由CK-M蛋白和CK-B蛋白通过Loop连接形成，所述Loop的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的CK-MB融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1或2所述的CK-MB融合蛋白的编码基因。4.权利要求1或2所述的CK-MB融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将人源性CK-M蛋白和CK-B蛋白的编码基因序列用Loop的核苷酸碱基偶联在一起，克隆到表达载体pET28a的多克隆位点BamHI/XhoI中，得到表达质粒pET28a-CKMB；将表达质粒pET28a-CKMB转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达；培养结束后培养液用Tris-盐酸缓冲液搅拌振荡使细菌沉淀重悬，超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和SuperdexG200分子筛层析柱，得到纯化的CK-MB蛋白。5.以权利要求1或2所述的CK-MB融合蛋白作为抗原，制备的抗体。6.一种用于检测CK-MB的试剂盒，包括CK-MB蛋白的阳性对照品，其特征在于，所述CK-MB蛋白为权利要求1或2所述的CK-MB融合蛋白。7.一种用于检测CK-MB的免疫荧光试...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑忠亮，
申请(专利权)人：郑忠亮，
类型：发明
国别省市：湖北,42