cTnI‑cTnC‑cTnT三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了cTnI‑cTnC‑cTnT三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒。该三聚体蛋白由cTnI蛋白、cTnC蛋白和cTnT蛋白依次连接形成。其制备方法是人工合成三聚体蛋白的编码基因，克隆到表达载体得到表达质粒，再将其转化到大肠杆菌，IPTG诱导表达；培养结束后培养液用Tris‑盐酸缓冲液搅拌振荡使细菌沉淀重悬，超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Sephedex G200分子筛层析柱，得到纯化的活性蛋白。以该蛋白作为阳性标准品，制备了以稀土荧光微球为载体的时间分辨荧光定量检测试剂盒，用于检测样本中的cTnI，具有稳定、敏感、定量、简便、快速、结果可靠的特点。

CTnI cTnC cTnT trimer protein and its preparation method and cTnI Kit

The invention discloses a cTnI cTnC cTnT trimer protein and its preparation method and cTnI kit. The trimer protein is sequentially connected by cTnI protein, cTnC protein and cTnT protein. The preparation method of synthetic gene encoding trimeric protein, was cloned into the expression vector plasmid, then transformed into Escherichia coli IPTG induced expression; at the end of the culture medium with Tris hydrochloric acid buffer to precipitate resuspended bacterial oscillating stirring, ultrasonic broken wall, then centrifuged, followed by nickel strong anion column, column Q and Sephedex G200 molecular sieve chromatography exchange, get active protein purification. Using this protein as a positive standard preparation of rare earth fluorescent microspheres as the carrier of the time-resolved fluorescence quantitative detection kit for the detection of samples of cTnI, with a stable, sensitive, quantitative, simple, rapid and reliable characteristics.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及cTn三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒，具体是涉及一种肌钙蛋白三个亚基cTnI、cTnC和cTnT融合三聚体蛋白及其基因工程表达及一种检测这三种亚基蛋白的时间分辨荧光定量检测试剂盒。
技术介绍
肌钙蛋白是由T、C、I三个亚基构成，和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4～6小时后，开始在血液中升高，升高的肌钙蛋白I能在血液中保持很长时间6～10天。肌钙蛋白在急性心肌梗死中的作用是巨大的，无论是溶栓、经皮冠状动脉介入术(PCI)、还是冠脉搭桥术(CABG)，都是风险极大的治疗手段，所以“冠心病，急性心肌梗塞”诊断的正确性就显得尤为重要。长期以来临床工作者一直致力于寻找一种高敏感性和高特异性血清诊断指标，以期提高诊断正确性。在近几十年中曾经有很多血清诊断指标在临床中得到应用，从天冬氨酸氨基转移酶(AST)到乳酸脱氢酶(LDH)，再到肌红蛋白、肌酸激酶(CK)、心肌肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌酸激酶同工酶质量(CK-MBmass)，最后到心肌肌钙蛋白(cardiactroponin，cTn)。这一演变体现心肌损伤标志物检测的敏感度和特异度越来越高，目前高敏肌钙蛋白(hs-cTn)可以检出非常微小的心肌损伤。肌钙蛋白在临床实践中成为目前公认的高敏感性和高特异性指标为所有指南所推荐。现阶段，临床上cTnI的检测方法有双抗夹心免疫化学发光法、放射性免疫法、酶联免疫法(ELISA)、免疫层析法等。双抗夹心免疫化学发光法敏感度高、所需时间短等优点，但是不能检测正常人血中的cTnI。放射性免疫法是通过将放射活性分子共价交联至cTnI抗体免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来间接定量检测cTnI的一种超微量分析方法。具有特异性好、灵敏度高(可达ng和pg级)、操作简便、样品制备简单、精确定量等优点，但是该方法中操作人员会接触到放射性物质，可能会损害操作人员的身体，而且检测完成后怎样处置放射性材料也是个严重的问题。cTnI的酶联免疫检测方法时双抗夹心ELISA方法，将一对cTnI单抗分别进行酶标板固化和酶标记，抗原抗体反应后，通过酵素呈色反应，即可显示特定抗原是否存在，并可根据呈色之深浅进行定量分析。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、样品能量大、不但能进行定性检测也能定量检测，但是耗时较长。侧向层析法在疾病快速诊断、小分子快速检测等领域已得到了广泛的应用。其原理是将特异性的抗原或抗体包被到硝酸纤维素膜上，构成检测线，将二抗包被在距离检测线在2～3毫米的区域构成质控线。当样本中的目标分子与带有特定标记物的检测抗体结合后，从硝酸纤维素酶的上样端向吸水端层析。由于毛细管作用，复合物将沿着膜向前移动，但移动到检测线时，样品中的目标分子将被检测线中的捕获抗体捕捉而停留在检测线，多余的检测抗体则通过检测线后被质控线的二抗所捕捉。常用的标记物为胶体金颗粒、荧光微球等。cTnI的胶体金免疫层析法通过静电吸附将cTnI抗体标记到胶体金颗粒表面，通过观察胶体金颗粒在检测线上的聚集显色判断检测结果。具有快速、简便、直观等优点，但同时存在着以存在依靠肉眼识别、灵敏度低、无法精确定量、标记通过静电吸附，标记产物不稳定等缺点。cTnI的免疫荧光层析技术是将cTnI抗体共价结合于荧光微球表面的活性基团(-COOH、-NH2)上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断检测结果，延续了胶体金免疫层析方法的优势，同时具有高敏感度、完全定量、标记物稳定的优点。在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术,是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体,因镧系稀土离子Stokes位移大，避免了激发光和发射光的重叠而影响结果，而且镧系稀土离子荧光寿命长，可以通过延长检测时间来消除检测物质本底荧光的干扰，提高了灵敏度，另外稀土元素的荧光强度高，同样能够提高检测的灵敏度。常用的稀土荧光微球为铕(EU)荧光微球。由于不同检测方法使用的质控品(阳性标准品)质量存在差异，导致检测结果出现几十倍或者更高的差异，给诊断准确性造成较大影响。Hytest公司从心肌组织中提纯获得一种cTnI-cTnC-cTnT三元复合体在2002年获得了NIST认证，但近年来的研究指出使用该三元复合物并没有使不同cTnI检测方法结果之间的可比性有所提高。新近的研究表明可以使用原核表达的方法直接表达出患者血清中cTnI的主要存在形式，在扩增出的cTnI和cTnC基因之间加上57个碱基的Linker序列(19个中性氨基酸残基TS-(G4S)3-AC)，转化pET28a表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，经NTA树脂亲和层析纯化，得到cTnI-cTnC融合蛋白。我们前期的实验结果显示，cTnI和cTnC二聚体的偶联原核表达只能得到包涵体，蛋白不可溶，在实际使用中仍然存在困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，具有抗原稳定性好的特性。而且该三聚体蛋白能够通过基因工程方式进行原核表达，获得具有活性的可溶性蛋白。本专利技术的另一个目的是提供上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体的制备方法。本专利技术的再一目的是提供上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体在作为阳性标准品制备检测cTnI的试剂盒中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：本专利技术提供的一种cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，由cTnI蛋白、cTnC蛋白和cTnT蛋白依次连接形成。我们研究发现，该三联体并不需要用到其他的loop序列，只需利用这三个蛋白本身的N末端的loop结构即可。优选地，上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还保护上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的编码基因。本专利技术提供的一种上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的制备方法，其包括以下步骤：人工合成cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的编码基因，克隆到表达载体pET28a的多克隆位点BamHI/XhoI中，得到表达质粒pET28a-cTnI；将表达质粒pET28a-cTnI转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达；培养结束后培养液用Tris-盐酸缓冲液搅拌振荡使细菌沉淀重悬，超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和SephedexG200分子筛层析柱，得到纯化的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白。镍柱也称为镍离子亲和层析柱，是以琼脂糖凝胶微球为基础，在其表面共价交联带有多个游离羧基的配体有机小分子化合物，由于多个羧基与Ni2+发生螯合，螯合后的Ni2+能与目标蛋白中His上的咪唑环发生特殊的相互作用，从而实现蛋白质的分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种cTnI‑cTnC‑cTnT三聚体蛋白，其特征在于，由cTnI蛋白、cTnC蛋白和cTnT蛋白依次连接形成。

【技术特征摘要】
1.一种cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，其特征在于，由cTnI蛋白、cTnC蛋白和cTnT蛋白依次连接形成。2.根据权利要求1所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.权利要求1或2所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的编码基因。4.权利要求1或2所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：人工合成cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的编码基因，克隆到表达载体pET28a的多克隆位点BamHI/XhoI中，得到表达质粒pET28a-cTnI；将表达质粒pET28a-cTnI转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达；培养结束后培养液用Tris-盐酸缓冲液搅拌振荡使细菌沉淀重悬，超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和SephedexG200分子筛层析柱，得到纯化的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白。5.以权利要求1或2所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白作为抗原，制备的抗体。6.一种cTnI的检测试剂盒，包括cTnI阳性标准品，其特征在于，所述cTnI阳性标准品为权利要求1或2所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白。7.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑忠亮，
申请(专利权)人：郑忠亮，
类型：发明
国别省市：湖北;42