一种高效的人工转录激活因子dCas9‑TV及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种高效的人工转录激活因子dCas9‑TV及其编码基因与应用。本发明专利技术在核酸酶失活的Cas9蛋白(dCas9)的羧基端连上多个拷贝的VP64和TAL转录激活结构域，产生一系列新型的人工转录激活因子，并筛选出转录激活活性最好的dCas9‑TV。当仅使用一个向导RNA(gRNA)靶向特定基因启动子时，dCas9‑TV能高效地激活拟南芥和水稻内源基因的转录。使用多个gRNA分别靶向多个靶基因时，dCas9‑TV能同时实现多基因的转录激活。另外，dCas9‑TV被证实在人类细胞中同样具有高效的靶向转录激活活性。利用体外组装的dCas9‑TV/gRNA核糖核蛋白复合体也能对拟南芥和水稻内源基因进行转录激活。综合以上优良活性，可将其应用基因组遗传筛选、代谢产物的生物合成通路改造、作物改良等方面。

【技术实现步骤摘要】
一种高效的人工转录激活因子dCas9-TV及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种高效的人工转录激活因子dCas9-TV及其编码基因与应用，属于生物
，特别是涉及基于基因过表达的农作物遗传改良和真核细胞代谢通路的人工调控。
技术介绍
转录调控是真核生物基因表达的重要环节，能通过改变转录速率从而改变基因表达的水平。这一过程涉及众多转录调控元件的共同参与。其中，转录激活因子能促进RNA聚合酶和启动子的相互作用，提高靶基因的转录水平。转录激活因子含有DNA结合域(DNA-bindingdomain)和转录激活域(transcriptionactivationdomain，TAD)，前者决定转录激活因子结合DNA序列的特异性，后者则具有转录激活的活性。通过基因工程手段，人为地将多种转录激活域和可编程的DNA结合域重新融合，可以设计并产生出新型的人工转录激活因子。通过DNA结合域与特定的靶基因启动子DNA序列的结合，人工转录激活因子可以特异地激活特定基因的转录。近年来，由ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑技术衍生的人工转录激活因子被陆续报道。这些人工转录激活因子为基因功能的研究、农作物改良、真核细胞代谢物的生产、合成生物学等领域提供了重要的技术手段。其中，CRISPR/Cas9衍生的人工转录激活因子由于其简便性和易操作性，具有最广泛的应用前景。CRISPR/Cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat/CRISPR-associatedprotein9)系统是原核生物用于抵御噬菌体或外来质粒入侵的适应性免疫系统。近年CRISPR/Cas9系统被改造成一个革命性的基因组编辑工具，包括Cas9核酸酶和向导RNA(gRNA)两个组成部分。Cas9核酸酶能与gRNA结合，gRNA通过碱基互补配对把Cas9引导至特定的DNA序列，随后Cas9发挥其核酸酶活性，使目标DNA发生双链断裂。DNA双链断裂能引发细胞的自我修复机制，如非同源末端连接(nonhomologousendjoiningrepair，NHEJ)和同源重组修复(homology-directedrepair，HDR)途径。前者导致双链断裂位点附近的碱基发生随机缺失或插入；后者则利用外界提供的同源DNA片段引发同源重组，产生精确的基因片段替换。两种途径都可能产生DNA序列的改变，从而达到基因编辑的目的。Cas9蛋白中的两个核酸酶活性中心HNH和RuvC发生点突变(D10A、H840A)后，可成为失去了DNA切割能力的dCas9(deadCas9)。dCas9仍然保持了在gRNA的引导下特异结合靶序列的能力。当把特定的转录激活结构域(如VP64、p65)与dCas9融合后，可获得新的人工转录激活因子。当其在gRNA的引导下结合到靶基因的启动子区域时，能特异地激活靶基因的转录。目前，尽管在人和动物细胞中已先后报道SunTag、SAM、VPR等多种高效的CRISPR/Cas9衍生的人工转录激活系统，但在植物细胞中高效的人工转录激活因子仍未见报道。目前植物细胞中常用的CRISPR/Cas9转录激活因子(如dCas9-VP64)效率极低，尤其是对于细胞内源基因。当只用单个gRNA结合到靶基因启动子时，大多数情况下dCas9-VP64转录激活因子最多只能上调靶基因转录不足2倍，无法满足靶基因转录激活的需要，大大限制了该技术的应用。只有同时使用多个gRNA定位到同一个基因的启动子时，dCas9-VP64转录激活因子才能达到一定的转录激活效果。但这一方面增加了脱靶的可能性，同时又增加了实验操作的复杂性，并降低了整个转录激活系统的通量(即同时激活多个基因的能力)。综上所述，在植物中目前仍缺乏高效的人工转录激活因子，难以实现有效的单个或多个内源基因的转录激活。同时，普遍适用于真核细胞(动植物)的人工转录激活系统也亟待开发。
技术实现思路
为了突破现有的技术障碍，本专利技术的目的是提供一种CRISPR/Cas9衍生的人工转录激活因子，通过增强其自身的转录激活活性，开发出仅使用单个gRNA便能显著激活靶基因转录的dCas9转录激活因子。本专利技术将大大简化单基因的靶向转录激活，从而更容易实现多基因转录激活，在基因组遗传筛选、代谢产物的生物合成通路改造、作物改良等方面具有广阔的应用前景。本专利技术的另一目的是提供一种CRISPR/Cas9衍生的人工转录激活因子的应用。本专利技术所采用的技术方案如下：本专利技术涉及一种高效的人工转录激活因子dCas9-TV，包含一个核酸酶失活的Cas9蛋白结构域和一个复合型转录激活结构域；该复合型转录激活结构域包含多个拷贝的VP64和TAL转录激活序列。进一步地，所述的人工转录激活因子dCas9-TV，该蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。进一步地，所述的人工转录激活因子dCas9-TV，其编码基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种基于dCas9-TV的人工基因转录激活系统，该系统包括上述人工转录激活因子dCas9-TV和由RNA聚合酶III型启动子驱动表达的gRNA；gRNA特异性靶向靶基因的启动子，数目可以为一个或多个。进一步地，所述的人工基因转录激活系统，该系统可在拟南芥和水稻等植物细胞以及人类细胞中应用，特异激活靶基因的表达。本专利技术还提供一种体外组装的dCas9-TV/gRNA核糖核蛋白转录激活因子复合体，该复合体包括重组表达并纯化的人工转录激活因子dCas9-TV，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；同时该系统还包括体外转录纯化的gRNA，gRNA特异性靶向靶基因的启动子。本专利技术还提供一个可用于特异性激活水稻内源GW7基因转录的gRNA，该gRNA对应的DNA序列如序列表SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供一个可用于特异性激活水稻内源ER1基因转录的gRNA，该gRNA对应的DNA序列如序列表SEQIDNO.4所示。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1)本专利技术的CRISPR/Cas9衍生的人工转录激活因子dCas9-TV能在仅使用一个gRNA的情况下高效地激活植物和人类细胞内源基因的转录，同时也能使用多个gRNA分别靶向多个启动子以同时实现多基因的转录激活，而体外组装的dCas9-TV/gRNA核糖核蛋白复合体也可成功地激活细胞内源基因的转录，同时排除分子克隆的需要，有效降低技术门槛。2)本专利技术的新型人工转录激活因子dCas9-TV较目前常用的dCas9-VP64在转录激活效率上有了很大提高，在基础研究、药物筛选和生产、农作物改良等方面有着广泛的应用前景。附图说明图1为CRISPR/Cas9衍生的人工转录激活因子结构示意图；dCas9为核酸酶失活的Cas9，NLS为核定位信号，VP64和TAL是两种转录激活结构域。FLAG蛋白标签便于dCas9-TV蛋白的westernblot检测。图2为4种dCas9人工转录激活因子在拟南芥原生质体中对WRKY30-LUC萤光素酶报告基因的转录激活效果比较以及SDS-PAGE电泳结果；Ctrl为空白对照。图3为5种dCas9人工转录激活因子在拟南芥原生质体中对WRKY30-LUC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效的人工转录激活因子dCas9‑TV，其特征在于，包含一个核酸酶失活的Cas9蛋白结构域和一个复合型转录激活结构域；该复合型转录激活结构域包含多个拷贝的VP64和TAL转录激活序列。

【技术特征摘要】
1.一种高效的人工转录激活因子dCas9-TV，其特征在于，包含一个核酸酶失活的Cas9蛋白结构域和一个复合型转录激活结构域；该复合型转录激活结构域包含多个拷贝的VP64和TAL转录激活序列。2.如权利要求1所述的人工转录激活因子dCas9-TV，其特征在于，该蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1所述的人工转录激活因子dCas9-TV，其特征在于，其编码基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。4.一种基于dCas9-TV的人工基因转录激活系统，其特征在于，该系统包括如权利要求1所述的人工转录激活因子dCas9-TV和由RNA聚合酶III型启动子驱动表达的gRNA；所述gRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎镇祥，李剑峰，张丹丹，熊翔宇，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44