本发明专利技术公开了一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。这对转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)由一对DNA识别蛋白分别与Fok1?DNA内切酶的两个异源亚基融合得到，可以特异性地识别山羊或绵羊β乳球蛋白基因(BLG)exon2上的两个相邻位点。将这对转录激活子样效应因子核酸酶同时转入宿主细胞时，其能对宿主细胞BLG基因的exon2位点打靶，并使打靶位点发生基因突变，从而实现对山羊或绵羊BLG基因的靶向修饰，具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。
技术介绍
按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入我们需要的序列，一方面可以构建出各种动物模型用于生物学基础研究和疾病机理研究，另一方面可以生产动物反应器用以廉价生产我们需要的又很难从其他途径得到的生物组分。其中，利用大动物乳腺生产药用或保健用蛋白不仅有巨大的经济价值，同时还具有很大程度降低整体医疗成本等社会价值。大动物乳腺器原理是通过基因组靶向修饰技术把目的蛋白定点敲入到乳腺高效并特异表达的蛋白启动子后，通过该启动子在大动物的乳腺中大量并特异的表达高价值的目的蛋白。β乳球蛋白基因是制造乳腺反应器的主要目的基因，其表达量高，并具有很强的时空特异性，只会在成年的雌性动物的乳腺中表达。表达的产物只会分泌到乳腺中，便以收集和提纯。但人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换，其打靶效率非常低，通常只有 10-6-10-8，这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用，而在其他模式动物及大型哺乳动物中都因效率太低而得不到广泛应用。近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般由序列特异的核酸酶由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成。原理是首先由DNA识别域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域，然后非特异性核酸内切酶切断双链 DNA从而造成DNA双链断裂(double-strand break，DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修复可以引起基因的突变和促进该位点DNA同源重组。锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)是现在研究最清楚也是应用最广的序列特异的核酸酶。其原理是两个锌指蛋白特异识别两段相隔5-7bp的DNA序列，并把与之融合表达的非特异性DNA切割蛋白R)kl的两个单聚体定位到了一起，DNA切割蛋白形成双聚体时可以切断该位置的双链DNA，从而造成 DSB。ZFN的出现使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步，然而，ZFN技术还存在靶向不确定性、效率低、拖把率高等问题，研究者很难自行设计出特异和高效的靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是制约ZFN广泛应用的瓶颈。而商业购买高效特异的锌指核酸酶又价格昂贵(20万人民币/基因)，一般研究者或商业公司根本无法承受这笔费用。2009年两个研究组发现植物病原体Xanthomonas中的一种可以调节植物基因表达的转录激活子样效应因子(transcription activator-like effector,TALE)表现出DNA 结合特异性，而其识别密码具有模块化和简单化的特点，为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。TALE与R)kl融合后即形成转录激活子样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALEN)。TALEN 的打靶原理与 ZFN 相同，只是识别特异DNA的蛋白不同。TALEs由数十个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的di-residUes(RVDs)位点。然而不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基。Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上。Edward Rebar领导的研究小组将带有不同C-末端TALE的截短片段连接到核酸酶 FokI的催化结构域上。当研究人员将构建的TALENs靶向内源性的人类NTF3和CCR5基因时，证实TALENs能够特异性地对这些基因片段进行剪切。哈佛大学研究小组开发了一种基于分层连接的策略来构建包含12个重复模块的TALEs。他们在保留RVDs的基础上减少了每个模块的DNA序列，同时将剩余序列的重复性降到最低。进而通过12重PCR获得了带有特异性连接序列的单体，并将其克隆至包含TALE N-末端和C-末端序列的骨架载体中。为了构建TALE转录因子，研究人员又将TALE融合到一个转录因子的激活域。在接下来的靶向性检测中，研究人员证实其能特异地使四个检测内源基因中的两个基因表达上调。今年7月MIT的Rudolf Jaenisch小组也验证了 TALEN在人胚胎干细胞和人iPSC 中的打靶效果。其通过在五个位点的TALENs与之前其在相同位置的ZFNs的打靶效果作对比，得出五组TALENs在打靶效率和精确度上都与从Sangamo Biosciences公司购买的ZFNs 相似，进一步验证了 TALENs是非常好的基因组编辑工具。
技术实现思路
本专利技术提供了一对短肽，利用这对短肽构建获得的一对转录激活子样效应因子 (TALE)能够特异性地识别山羊或绵羊β乳球蛋白基因(BLG) eX0n2上的二段相邻核苷酸； 利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)， 能够对山羊或绵羊β乳球蛋白基因进行准确、高效地打靶。一对短肽，所述一对短肽分别具有如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列。本专利技术提供了一对多核苷酸，所述一对多核苷酸分别编码上述的一对短肽。优选地，所述一对多核苷酸分别具有如SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4所示的碱基序列。其中，所述的多核苷酸由分别识别山羊或绵羊β乳球蛋白基因eXOn2上核苷酸序列SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 20中相应碱基的TALENs识别模块依序连接而成，其中，识别碱基A的TALENs识别模块为NI-A (如SEQ ID NO 22所示)，识别碱基T的TALENs识别模块为NG-T (如SEQID NO 23所示)，识别碱基C的TALENs识别模块为HD-C (如SEQ IDNO 24所示)，识别碱基G的TALENs识别模块为NK-G (如SEQ ID NO 25所示)。本专利技术还提供了一对蛋白质，所述一对蛋白质由上述的一对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成；其中，所述的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端为天然的或经过人工改造的序列。这对蛋白质可以分别特异性地识别山羊或绵羊β乳球蛋白基因(BLG)eXOn2上的二段核苷酸序列，所述二段核苷酸序列分别选自以下二个核苷酸序列(I)SEQ ID N0:16序列或SEQ ID NO 16序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO 20序列或SEQ ID NO :20序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列。优选地，所述的这对蛋白质分别具有如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列。该蛋白质为转录激活子样效应因子，命名为BLG-TALE-L1和BLG-TALE-R2本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖磊，赵金龙，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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