一种EGFP‑CTA2‑TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，特别涉及一种EGFP‑CTA2‑TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用。所述的EGFP‑CTA2‑TAT融合蛋白的结构中含有的TAT部分是穿膜肽能够帮助设计的荧光探针穿过细胞膜进入细胞内部；CTA2部分中含有内质网定位序列KDEL可实现对细胞内内质网的靶向定位；该融合蛋白最终通过激发EGFP发出绿色荧光，可实现对活细胞内内质网及其相应生理变化的实时微观示踪检测。与普通内质网染色剂相比具有良好的生物相容性、安全无毒且具有更高的靶向性和检测灵敏性的特点。

A EGFP CTA2 TAT fusion protein by using fluorescent probes in the system

The invention belongs to the technical field of biological engineering, in particular to a EGFP CTA2 TAT fusion protein by using fluorescent probes in the system. TAT contains the structure EGFP CTA2 TAT fusion protein in the membrane penetrating peptide can help the design of fluorescence probe through the cell membrane into the cell interior; part CTA2 contains endoplasmic reticulum localization sequence of KDEL can be realized on the intracellular endoplasmic reticulum targeting; the fusion protein through the excitation of the EGFP issue green fluorescence, can realize the real-time tracking of the micro living cells endoplasmic reticulum and corresponding physiological change detection. Compared with ordinary endoplasmic reticulum, it has good biocompatibility, safety and innocuity, and has the characteristics of higher targeting and detection sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用
本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用。
技术介绍
近几十年来，随着一些新的分子识别机理的建立、新型材料的开发与应用以及科技的进步，越来越多的生物荧光探针被发展用于生命科学学科中的基础研究。其研究的对象从均相溶液中的各种离子或分子过渡到生物体内的离子、小分子和生物大分子(酶、核酸、蛋白质等)。科研工作者们除了不断追求具有灵敏度更高、选择性更好的生物荧光探针的构建方法外，更注重将生物荧光探针应用于生物体内重要的信号转导分子的原位检测以及实时监测它们在生命代谢过程中的应激变化。这使得以生物荧光探针为主体的传感器成为研究生命科学工作中的重要工具，它们也极大地推动了生命科学的发展，并有助于研究者们去探索生命过程中的未知领域。已开发且用于检测细胞内目标物的生物荧光探针主要有：基于有机分子荧光探针、核酸或多肽的荧光探针、纳米材料探针以及绿色荧光蛋白探针等。实验室研究中多功能融合蛋白构建的技术已经相当成熟，EGFP具有绿色荧光、CTA2中含有内质网定位序列KDEL及TAT作为穿膜肽的身份已经众所周知。但是这种利用蛋白融合技术构建的具有良好生物相容性的生物大分子蛋白作为荧光探针的方法目前尚未见报道。
技术实现思路
为克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的氨基酸序列如下所示：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKASEFELGGGGSMSNTCDEKTQSLGVKFLDEYQSKVKRQIFSGYQSDIDTHNRIKDELVDGRKKRRQRRRPPQLEHHHHHH编码所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的核苷酸序列如下所示：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCTAGCGAATTCGAGCTCGGAGGTGGTGGATCCATGAGCAATACGTGCGATGAGAAGACACAAAGCCTGGGCGTGAAATTCTTAGACGAATATCAAAGCAAAGTGAAACGCCAAATCTTCAGCGGATACCAAAGCGATATTGACACGCACAATCGCATCAAGGATGAGTTAGTCGACGGTCGTAAGAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTCCACCACAGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的制备方法，包含如下步骤：将含有目的重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的EscherichiacoliBL21(DE3)菌种进行活化、扩大培养；然后进行目标蛋白的诱导表达，获得湿菌体；湿菌体悬浮裂解，并离心，得到上清蛋白溶液；上清蛋白溶液进行镍柱亲和层析，透析除盐，冷冻干燥，得到EGFP-CTA2-TAT融合蛋白；所述的活化的具体步骤优选为：(1)将含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coliBL21(DE3)菌种保藏液在含有终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃、200r/min培养3～4h；(2)将步骤(1)制得的菌液划平板，37℃固体培养12～14h；(3)挑步骤(2)培养得到的单菌落于含有终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃、200r/min培养12～14h；(4)将甘油和步骤(3)制得的菌液混合，得到活化后的含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coliBL21(DE3)单克隆菌种菌液；所述的扩大培养的具体步骤优选为：(1)将活化后的含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coliBL21(DE3)单克隆菌种菌液以体积比1:100的比例接种到含终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养12～14h；(2)将步骤(1)中培养的菌液按照体积比1:50转接到含终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、200r/min扩大培养4h；所述的诱导表达的条件优选为：采用终浓度为1mmoL/L的IPTG，37℃、200r/min诱导5h；所述的悬浮裂解的具体步骤优选为：将湿菌体悬浮于裂解缓冲液中，加入溶菌酶并搅拌均匀；将上述混合液进行反复冻融，直至菌体充分裂解，不再粘稠；若反复冻融之后菌液依然粘稠则加入DNA酶进一步裂解，直至菌体充分裂解，不再粘稠；所述的湿菌体和裂解缓冲液的质量体积比优选为1g:10mL；所述的裂解缓冲液优选为PBS缓冲液；所述的溶菌酶的终浓度优选为80μg/mL；所述的镍柱亲和层析的具体操作优选为：层析柱湿法装填料(Ni-琼脂糖凝胶6FF(His标签纯化树脂))，用PBS缓冲液进行层析柱平衡，上清蛋白溶液上样；上样完毕之后再次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种EGFP‑CTA2‑TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：所述的EGFP‑CTA2‑TAT融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：编码权利要求1中所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白的制备方法，包含如下步骤：将含有目的重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的EscherichiacoliBL21(DE3)菌种进行活化、扩大培养；然后进行目标蛋白的诱导表达，获得湿菌体；湿菌体悬浮裂解，并离心，得到上清蛋白溶液；上清蛋白溶液进行镍柱亲和层析，透析除盐，冷冻干燥，得到EGFP-CTA2-TAT融合蛋白。4.根据权利要求3所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：所述的活化的具体步骤为：(1)将含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coliBL21(DE3)菌种保藏液在含有终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃、200r/min培养3～4h；(2)将步骤(1)制得的菌液划平板，37℃固体培养12～14h；(3)挑步骤(2)培养得到的单菌落于含有终浓度为50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃、200r/min培养12～14h；(4)将甘油和步骤(3)制得的菌液混合，得到活化后的含有重组质粒pET22b-EGFP-CTA2-TAT的E.coliBL21(DE3)单克隆菌种菌液。5.根据权利要求3所述的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白在制备荧光探针中的应用，其特征在于：所述的扩大培养的具体步骤为：(1)将活化后的含有重组质粒pET2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王甜甜，王华倩，林丹敏，何华锋，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44