一种抗稻褐飞虱的杀虫蛋白HY131c及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术提供的蛋白质，包括Cry1Ac的结构域I、Cry30Fa1结构域II及Cry1Ac结构域III；为将所述Cry1Ac蛋白中的结构域II替换为所述Cry30Fa1蛋白的结构域II得到的蛋白质。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术提供的新型杀虫蛋白对稻褐飞虱有高毒力，为水稻抗稻褐飞虱提供了新的策略，具有广阔的应用前景。

Insecticidal protein HY131c and its encoding gene and application of a kind of rice brown planthopper resistant to rice

The invention discloses a insecticidal protein of the rice brown planthopper and its encoding gene and its application. The protein provided by the invention includes the domain I, Cry30Fa1 domain II and Cry1Ac domain III of Cry1Ac, and the protein obtained by replacing the domain II of the Cry1Ac protein into the II domain of the Cry30Fa1 protein. The experiment of the invention proves that the new insecticidal protein provided by the invention has high toxicity to rice brown planthopper, and provides a new strategy for rice resistance to rice brown planthopper, and has wide application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种抗稻褐飞虱的杀虫蛋白HY131c及其编码基因与应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种抗稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
水稻是世界范围内重要的粮食作物，然而水稻的病虫害严重影响了水稻的生产。随着转Cry1Ab及Cry1Ac等Bt蛋白水稻株系的推广种植预期可有效的防治鳞翅目和鞘翅目害虫的危害(Shu,Yeetal.2000,Breitler,Vassaletal.2004,Cohen,Chenetal.2008)。但是，也不可避免的促进了非靶标害虫昆虫如褐飞虱的种群数量和危害程度(Chenetal.2011)。因此，创制发展对稻褐飞虱等害虫有高毒力的新型杀虫基因迫在眉睫。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis简称Bt)是一种土壤杆菌，它在逆境条件下会形成芽孢并产生伴胞晶体，伴孢晶体由不同种Cry蛋白组成(亦被称为δ内毒素；δ-Endotoxins)，其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫具有杀虫活性(Bravo,Likitvivatanavongetal.2011)。Cry蛋白的杀虫活性区通常由三个结构域组成，其中结构域I主要负责在昆虫中肠膜上形成孔洞，结构域II主要负责与昆虫中肠膜上受体结合，由此确定毒素特异性，结构域III的功能比较复杂，包括维持蛋白质的稳定性、协助结构域I在膜上穿孔及协助结构域II与膜上受体结合等等。通过对不同Cry蛋白的结构域II互换，会产生对某种害虫毒性增强的新的杀虫蛋白，因此通过结构域互换产生新的杀虫蛋白的方法被广泛的应用于Cry蛋白的改造(SaraswathyandKumar2004,Florez,Osorioetal.2012)。Cry蛋白对害虫的毒力非常高，且杀虫谱很窄，某一特定的Cry蛋白通常只对一种或几种昆虫起作用而对非靶标害虫及人畜完全无害。鉴于Cry蛋白的高效性和安全性，Cry基因也成为目前应用最广的用于抗虫转基因作物的杀虫基因(Romeis,Meissleetal.2006,Sanahuja,Banakaretal.2011)。然而，目前所发现的Cry蛋白主要是针对鳞翅目、鞘翅目和双翅目等害虫，对具有刺吸式口器的半翅目昆虫没有明显毒性(ChouguleandBonning2012)。鉴于稻褐飞虱对水稻生产的重大危害，迫切的需要研发针对此类害虫的新型抗性基因。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供抗稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因。本专利技术提供的蛋白质，为HY131c，包括Cry1Ac的结构域I、Cry30Fa1结构域II及Cry1Ac结构域III。该蛋白为将所述Cry1Ac蛋白中的结构域II替换为所述Cry30Fa1蛋白的结构域II得到的蛋白质。根据本专利技术，如在此定义的通过交换Cry1Ac及Cry30Fa1的结构域II，设计了相比于Cry1Ac及Cry30Fa1具有实质上改变的生化特性及杀虫活性的HY131c蛋白。本专利技术所创制HY131c蛋白全长为619位氨基酸，其序列1到254位氨基酸来源于Cry1Ac，具有强的在昆虫中肠膜上形成空洞的能力；255到467位氨基酸来源于Cry30Fa1，具有与稻褐飞虱中肠膜上受体特异结合的能力；468到619位氨基酸来源于Cry1Ac，具有稳定蛋白空间结构等功能。其序列经NCBIBlastp分析第48-251位氨基酸具有δ内毒素结构域I特征，其序列第261-465位氨基酸具有δ内毒素结构域II特征；其序列475-613位氨基酸具有δ内毒素结构域III特征。本专利技术所创制蛋白分子量为69353.4Da，等电点为4.98。本专利技术所创制HY131c蛋白序列与NCBI数据库中已知序列比对，同源性最高为73％。上述蛋白质为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)或c)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗虫功能的蛋白质；d)与a)或b)或c)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有抗虫功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码上述蛋白的核酸分子也是本专利技术保护的范围。上述核酸分子为如下1)-6)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列1；2)其编码序列包括序列表中序列3；3)其编码序列为序列表中序列1；4)其编码序列为序列表中序列3；5)在严格条件下与1)-4)中任一限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；6)与1)-4)中任一限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。HY131c蛋白编码基因的核酸序列全长为1860bp。本专利技术所创制HY131c基因序列与NCBI数据库中已知序列比对，仅有65％的部分与已提交序列有同源性，这一部分来源于Cry1Ac基因。与蛋白质序列相对应的，HY131c基因序列第1-762位核苷酸来自于Cry1Ac基因，第763-1401位核苷酸来自于Cry30Fa1基因，第1402-1860位核苷酸来自于Cry1Ac基因。本序列所用密码子为水稻优势密码子。本序列亦去除了影响mRNA稳定的一些基序，包括可能的mRNA剪切位点、可能的mRNA加PolyA位点、重复的PolyA及PolyT序列以及一些正向或反向的重复序列。用此序列产生的转基因水稻株系可以高效的表达本基因所编码蛋白，并提供高水平的防治害虫的能力。序列3为序列1的优化前序列。本优化方案适用于但不限于在水稻中高水平表达HY131c蛋白。首先本序列所用密码子为水稻最优势密码子。序列优化时同时考虑到5’非编码区及3’非编码区对基因所转录之mRNA整体二级结构的影响，以确保mRNA具有更稳定，更利于高效翻译其所编码的蛋白的能力。本序列亦去除了影响mRNA稳定的一些基序，包括可能的mRNA剪切位点、可能的mRNA加PolyA位点、重复的PolyA及PolyT序列以及一些正向或反向的重复序列。另外，为了有效的翻译起始，可能需要修饰与起始甲硫氨酸相邻的序列，Lütcke(Lütcke,Chowetal.1987)提出针对植物的一种合适的共有序列为：AACAAUGGC，Joshi(Joshi,Zhouetal.1997)等提出适合单子叶植物的序列C(A/C)(A/G)CAAUGGCG，Furukawa(Furukawa,Maekawaetal.2006)等发现了一个高效的适用于水稻的序列GCCGCCATGG。另外，为了有效的提高翻译效率同时引入了Ω序列(Sleat,Gallicetal.1987,Gallie,Sleatetal.1988)。应用本优化方案所得到的序列所产生的转基因水稻株系可以高水平的表达本基因所编码蛋白，并提供高水平的防治害虫的能力。下述1)-4)中的任一种生物材料也是本专利技术保护的范围：1)含有上述核酸分子的表达盒；2)含有上述核酸分子的重组载体；3)含有上述核酸分子的重组菌；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，包括Cry1Ac的结构域I、Cry30Fa1结构域II及Cry1Ac结构域III。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，包括Cry1Ac的结构域I、Cry30Fa1结构域II及Cry1Ac结构域III。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为将所述Cry1Ac蛋白中的结构域II替换为所述Cry30Fa1蛋白的结构域II得到的蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗虫功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有抗虫功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。4.编码权利要求1-3中任一所述蛋白的核酸分子。5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-6)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列1；2)其编码序列包括序列表中序列3；3)其编码序列为序列表中序列1；4)其编码序列为序...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱祯，刘哲铭，陈书元，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11