嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用。所述嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域来自NKG2D的配体结合区，所述胞内结构域来自DAP12的胞内信号区。用本发明专利技术的嵌合抗原受体修饰的工程化NKG2D配体靶向性的NK细胞为治疗NKG2D配体阳性肿瘤患者提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。

Chimeric antigen receptor, modified NK cell, coded DNA, mRNA, expression vector, preparation method and Application

The invention provides a chimeric antigen receptor, a modified NK cell, a coded DNA, a mRNA, an expression vector, a preparation method and an application. \u6240\u8ff0\u5d4c\u5408\u6297\u539f\u53d7\u4f53\u5305\u62ec\u53ef\u64cd\u4f5c\u5730\u8fde\u63a5\u7684\u3001\u4f9d\u6b21\u4e32\u8054\u7684\u6297\u539f\u7ed3\u5408\u7ed3\u6784\u57df\u3001\u95f4\u9694\u533a\u3001\u8de8\u819c\u533a\u548c\u80de\u5185\u7ed3\u6784\u57df\uff0c\u5176\u7279\u5f81\u5728\u4e8e\uff0c\u6240\u8ff0\u6297\u539f\u7ed3\u5408\u7ed3\u6784\u57df\u6765\u81eaNKG2D\u7684\u914d\u4f53\u7ed3\u5408\u533a\uff0c\u6240\u8ff0\u80de\u5185\u7ed3\u6784\u57df\u6765\u81eaDAP12\u7684\u80de\u5185\u4fe1\u53f7\u533a\u3002 The engineered NKG2D ligand targeted NK cells modified by the chimeric antigen receptor of this invention provide a new choice for the treatment of NKG2D ligand positive tumor patients, and has good industrial application prospects.

【技术实现步骤摘要】
嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体而言，涉及嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用。
技术介绍
近几年随着对免疫机制的了解，导致了继手术治疗、化疗、放射性治疗之后又一治疗癌症的新技术的产生，即免疫治疗。癌症的免疫治疗被《Science》杂志评为2013年世界年度科技突破。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor，CAR)是经人工改造的受体，因此可将任意的特异性受体嫁接到免疫效应细胞上。通常，这些受体的用于识别抗原的胞外特异性部分来自抗体的序列。由于这种受体的不同部分有不同的来源，因此被称为嵌合受体。CAR修饰的免疫细胞即表达嵌合性抗原受体(CAR)的免疫细胞，是现在最有效，最有希望的肿瘤细胞免疫治疗产品。自然杀伤细胞(NK)是机体重要的免疫细胞，在外周血单个核细胞组成中占10％左右，是人体抗肿瘤、抗病毒感染的第一道防线。NK细胞与T细胞不同，不会产生自分泌生长因子如IL-2，而且相比T细胞，在遇到特异性抗原时不会增值过快，寿命较短，不需要装备自杀基因，也能限制CAR毒性。除此以外，NK细胞对肿瘤的杀伤不依赖于MHC呈递的特异性抗原，因此，在异体NK细胞的免疫治疗应用上，不会产生免疫排斥作用，是一种比T细胞更为安全的免疫治疗候选细胞。理论上，CAR可以避开NK细胞内抑制性信号通路，同时NK细胞自身可表达激活型受体，还能利用抗体介导的细胞毒作用(ADCC)，因此，CAR表达的NK细胞在肿瘤治疗上更优于T细胞，有着更为广阔的应用前景。CAR包括胞外部分、跨膜区和胞内部分。对于携带CAR的免疫细胞而言，CAR的胞外部分和胞内部分的选择、及其与免疫细胞种类的配合极为重要，这与对肿瘤的特异性杀伤能力密切相关。目前在肿瘤的免疫治疗中，仍然需要开发出可供选择的新型且效果良好的CAR-免疫细胞药物。
技术实现思路
为解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术提供了嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用。具体而言，本专利技术提供了：(1)一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域来自NKG2D的配体结合区，所述胞内结构域来自DAP12的胞内信号区。(2)根据(1)所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83。(3)根据(1)或(2)所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。(4)根据(1)所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的第62-113位氨基酸；优选地，所述胞内结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。(5)根据(1)所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区来自CD8α的铰链区，所述跨膜区来自CD8α的跨膜区。(6)根据(1)或(5)所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区和跨膜区构成间隔跨膜区，并且其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128。(7)根据(6)所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。(8)根据(1)所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。(9)一种分离的、编码嵌合抗原受体的DNA，该DNA包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域编码元件、间隔区编码元件、跨膜区编码元件和胞内结构域编码元件，其特征在于，所述抗原结合结构域编码元件来自NKG2D的配体结合区编码DNA，所述胞内结构域编码元件来自DAP12的胞内信号区编码DNA。(10)根据(9)所述的DNA，其中所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列编码所述抗原结合结构域的氨基酸序列，所述抗原结合结构域的氨基酸序列与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83。(11)根据(9)或(10)所述的DNA，其中所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。(12)根据(9)所述的DNA，其中所述胞内结构域编码元件编码所述胞内结构域的氨基酸序列，所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的第62-113位氨基酸；优选地，所述胞内结构域编码元件的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。(13)根据(9)所述的DNA，其中所述间隔区编码元件来自CD8α的铰链区编码DNA，所述跨膜区编码元件来自CD8α的跨膜区编码DNA。(14)根据(9)或(13)所述的DNA，其中所述间隔区编码元件和所述跨膜区编码元件构成间隔跨膜区编码元件，所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列编码所述间隔跨膜区的氨基酸序列，所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128。(15)根据(14)所述的DNA，其中所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。(16)根据(9)所述的DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。(17)一种分离的、由根据(9)-(16)中任一项所述的DNA转录的mRNA。(18)一种重组表达载体，其含有与启动子有效连接的根据(9)-(16)中任一项所述的DNA。(19)根据(18)所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体在根据(9)-(16)中任一项所述的DNA之前依次包含CMV启动子、T7启动子、具有kozak序列的5’UTR和GM-CSFα链信号肽编码序列；并且在根据(9)-(16)中任一项所述的DNA之后包含具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR。(20)一种嵌合抗原受体修饰的NK细胞，该NK细胞的表面被(1)-(8)中任一项所述的嵌合抗原受体修饰。(21)一种制备根据(20)所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞的方法，包括以下步骤：1)提供NK细胞；2)提供编码根据(1)-(8)中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸；3)将所述核酸转染入所述NK细胞中。(22)根据(21)所述的方法，其中步骤1)所述的NK细胞由外周血单个核细胞制备。(23)根据(21)所述的方法，其中所述转染通过冷冻电穿孔技术或慢病毒载体进行。(24)根据(21)所述的方法，其中步骤2)所述的核酸为根据(9)-(16)中任一项所述的DNA、或根据(17)所述的mRNA。(25)根据(20)所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。(26)根据(25)所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症是NKG2D配体阳性的。(27)根据(20)所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备用于检测宿主的肿瘤和/或癌症的药物中的用途。(28)一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据(20)所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞，及可药用辅料。(29)根据(28)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含每人每个疗程总剂量范围为1×106-1×1011个的所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞。(30)根据(28)所述的药物组合物，其中所述药物组合物的给药方式包括静脉给药或局部给药。(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域来自NKG2D的配体结合区，所述胞内结构域来自DAP12的胞内信号区。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域来自NKG2D的配体结合区，所述胞内结构域来自DAP12的胞内信号区。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83。3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的第62-113位氨基酸；优选地，所述胞内结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区来自CD8α的铰链区，所述跨膜区来自CD8α的跨膜区。6.根据权利要求1或5所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区和跨膜区构成间隔跨膜区，并且其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128。7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。8.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。9.一种分离的、编码嵌合抗原受体的DNA，该DNA包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域编码元件、间隔区编码元件、跨膜区编码元件和胞内结构域编码元件，其特征在于，所述抗原结合结构域编码元件来自NKG2D的配体结合区编码DNA，所述胞内结构域编码元件来自DAP12的胞内信号区编码DNA。10.根据权利要求9所述的DNA，其中所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列编码所述抗原结合结构域的氨基酸序列，所述抗原结合结构域的氨基酸序列与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83。11.根据权利要求9或10所述的DNA，其中所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。12.根据权利要求9所述的DNA，其中所述胞内结构域编码元件编码所述胞内结构域的氨基酸序列，所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的第62-113位氨基酸；优选地，所述胞内结构域编码元件的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。13.根据权利要求9所述的DNA，其中所述间隔区编码元件来自CD8α的铰链区编码DNA，所述跨膜区编码元件来自CD8α的跨膜区编码DNA。14.根据权利要求9或13所述的DNA，其中所述间隔区编码元件和所述跨膜区编码元件构成间隔跨膜区编码元件，所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列编码所述间隔跨膜区的氨基酸序列，所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128。15.根据权利要求14所述的DNA，其中所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。16.根据权利要求9所述的DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。17.一种分离的、由根据权利要求9-16中任一项所述的DNA转录的mRNA。18.一种重组表达载体，其含...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖琳，陈璨，
申请(专利权)人：杭州优善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33