嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CAR133‑NKT 细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于肿瘤生物制品领域，公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CAR133‑NKT细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体为CD133ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、CD133ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。采用本发明专利技术的CAR133‑NKT细胞与CD133阳性的上皮肿瘤细胞共培养时，对CD133阳性上皮肿瘤细胞具有很好的特异杀伤活性。本发明专利技术的CAR133‑NKT细胞在治疗CD133阳性的上皮肿瘤时，对上皮肿瘤具有一定的治疗效果。

The expression of chimeric antigen receptor gene and recombinant vector, CAR133 NKT cell and preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of tumor biological products, discloses a chimeric antigen receptor gene and recombinant expression vector, CAR133 NKT cells and a preparation method and application of the chimeric antigen receptor for CD133ScFv CD8 CD137 CD3 zeta signal domain, CD137 hinge region including CD8a signal peptide, CD133ScFv, CD8 series and the transmembrane region and intracellular signaling domain and intracellular CD3. The invention of the CAR133 NKT cells and CD133 positive epithelial tumor cell co culture, has the good specific killing activity on CD133 positive epithelial tumor cells. The invention of the CAR133 NKT cells in the treatment of CD133 positive epithelial tumor, has certain therapeutic effect on epithelial tumor.

【技术实现步骤摘要】
嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CAR133-NKT细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受体CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化CD133靶向性的NKT细胞(CAR133-NKT细胞)及其制备方法和应用。
技术介绍
自然杀伤细胞(NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，在TCR和NKR介导下，NKT细胞能够产生大量的IL-4及INFγ，对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。NKT细胞通过自身表面的CD16与特异性抗体的Fc段结合，发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC，antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)。但在抗体依赖的细胞介导的杀伤作用过程中，由于抗体能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，NKT细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，因此抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，但NKT细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。另外，通常情况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复多次输注。而且，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了NKT细胞对恶性肿瘤的靶向治疗。再者，研究表明，NKT细胞并不是对所有的肿瘤都有杀伤效果，且对部分肿瘤的杀伤作用比较弱，特异杀伤活性有待提高，NKT细胞对肿瘤干细胞的免疫监视目前仍然存在争议。肿瘤干细胞是一类特殊的肿瘤细胞，其占肿瘤细胞的比率较低，但具有自我更新，并分化为其他不同肿瘤细胞的潜能。大量研究指出，肿瘤干细胞与肿瘤的复发及远端转移具有很大的相关性，并且可能是肿瘤对放化疗产生抵抗的缘由。CD133是细胞表面的糖蛋白，可作为分离肿瘤组织中肿瘤干细胞的标记。另外，CD133在多种肿瘤细胞表面呈现高表达，如结直肠癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、脑肿瘤、黑色素瘤或神经胶质瘤等。研究发现肿瘤起始细胞群里含有大量的CD133阳性的细胞，同时，CD133的高表达与肿瘤治疗差的预后有关，由于以上特性，CD133抗原成为以抗体为基础治疗的理想靶点，但目前仍没有一种对肿瘤特异杀伤活性较高的制剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高的缺陷，充分利用CD133治疗肿瘤的理想靶点的作用，提供一种嵌合抗原受体CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化CD133靶向性的NKT细胞(CAR133-NKT细胞)及其制备方法和应用。本专利技术的专利技术人在研究中意外发现，采用本专利技术的嵌合抗原受体CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞与CD133阳性的上皮肿瘤细胞共培养时，对肿瘤细胞具有很好的特异杀伤活性。因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、CD133ScFv、CD8的铰链区(hinge区)和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。第二方面，本专利技术提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。第三方面，本专利技术提供了含有上述基因的重组表达载体。第四方面，本专利技术提供了一种工程化CD133靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上述嵌合抗原受体CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞。第五方面，本专利技术提供了一种工程化CD133靶向性的NKT细胞的制备方法，所述方法包括：包装携带PWPT-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。第六方面，本专利技术提供了上述方法制备得到的工程化CD133靶向性的NKT细胞。第七方面，本专利技术提供了上述工程化CD133靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。第八方面，本专利技术提供了一种治疗CD133阳性的上皮肿瘤和/或抑制肿瘤复发与转移的方法，该方法包括：向CD133阳性的上皮肿瘤患者体内回输本专利技术的工程化CD133靶向性的NKT细胞。在与CD133阳性的上皮肿瘤细胞共培养时，本专利技术的嵌合抗原受体CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，即工程化CD133靶向性的NKT细胞能够特异性结合CD133抗原，增强免疫细胞靶向识别癌细胞表面CD133抗原的能力，加强对CD133阳性靶细胞的特异杀伤活性。本专利技术的工程化CD133靶向性的NKT细胞为治疗CD133阳性的肿瘤及阻遏肿瘤转移与复发提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。图2为本专利技术的慢病毒表达载体PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶MluI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。图3为本专利技术的慢病毒表达载体PWPT-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶BamHI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。图4为本专利技术的慢病毒表达载体PWPT-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的结构示意图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒浓缩液对NKT细胞的感染效率。图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(CAR133-NKT细胞)表型鉴定的结果。图7(A)-图7(C)为本专利技术的实施例4中不同CD133表达水平的上皮肿瘤细胞的CD133表达水平分析图。图8为本专利技术的实施例4中CAR133-NKT细胞对不同CD133表达水平的上皮肿瘤细胞的杀伤作用分析图(4小时)。图9为本专利技术的实施例4中CAR133-NKT细胞对不同CD133表达水平的上皮肿瘤细胞的杀伤作用分析图(8小时)。图10为本专利技术的实施例6中CAR133-NKT细胞对造血系统的功能影响分析图。图11-图13为本专利技术的实施例7中CAR133-NKT细胞回输于患者体内后CAR133基因拷贝数变化曲线图。图14-图16为CAR133-NKT细胞治疗过程中肝癌患者CD133阳性细胞数的变化曲线图。图17为本专利技术的实施例7中CAR133-NKT细胞对肝癌患者的治疗效果的分析图。图18-图21为本专利技术的实施例7中CAR133-NKT细胞对转移性胰腺癌患者治疗的血液系统毒副反应的分析图，分别显示了不同细胞回输后天数时血红蛋白(Hgb)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)和网织红细胞(Ret)的变化趋势。图22(A)-图22(F)为本专利技术的实施例7中CAR133-NKT细胞回输于患者体内后CAR133基因拷贝数变化曲线图。图23为本专利技术的CAR133-NKT细胞治疗过程中患本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD133ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、CD133ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、CD133ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的基因，优选地，所述基因具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，进一步优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求2所述的基因的重组表达载体，优选地，所述重组表达载体为慢病毒表达载体，进一步优选地，所述慢病毒表达载体为PWPT-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。4.一种工程化CD133靶向性的NKT细胞，其特征在于，所述NKT细胞是由权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的NKT细胞。5.一种工程化CD133靶向性的NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：包装携带PWPT-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体CD133ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法还包括通过如下方法制备NKT细胞：(1)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶段培养；优选地，所述第一阶段培养的实施方式包括：将单个核细胞培养于第一NKT细胞培养液中，所述第一NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15；进一步优选地，第一NKT细胞培养液中，所述CD3单克隆抗体的浓度为30-70ng/mL，和/或所述白介素-2的浓度为300-700U/mL，和/或所述白介素-15的浓度为30-70ng/mL；(2)在白介素-2存在下，将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：广州百尼夫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44