半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物及其制备方法技术

本发明专利技术将目标抗体的重链和轻链定点插入半胱氨酸(C)，通过定点插入的半胱氨酸的游离巯基(‑SH)与偶联了小分子高活性细胞毒素的连接子进行定点偶联，形成均一性优良的半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物。本发明专利技术中披露的半胱氨酸插入位点为抗体轻链第205位和/或第206位(Kabat编号)，和/或重链第439位(Kabat编号)。

Toxin antibody conjugates of cysteine modification and preparation method thereof

【技术实现步骤摘要】
半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物及其制备方法
本专利技术涉及一种化合物及其制备方法，特别涉及一类半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物及其制备方法。技术背景抗体-毒素偶联物(Antibodydrugconjugate,ADC)是靶向治疗的热点领域，已在美国获批上市的两个药物Adcetris和Kadcyla表现出良好的临床疗效，并且有超过50个ADC药物在进行临床阶段研究。
技术实现思路
本专利技术的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)，半胱氨酸插入位点包含选自以下3个插入位点的一个或多个位点：轻链第205位(Kabat编号，其氨基酸序列为GLSSPCVTKSF)，轻链第206位(Kabat编号，其氨基酸序列为GLSSPVCTKSF)，重链第439位(Kabat编号，其氨基酸序列为YTQKSLSCLSPGK)。包含一个或多个上述半胱氨酸插入突变的抗体保持了其亲本抗体与抗原结合的能力(亲和力)。本专利技术通过其轻链第205位或/和第206位或/和重链第439位插入的半胱氨酸巯基与linker-drug进行抗体-毒素偶联物(TDC)定点偶联。氨酸改造的抗体-毒素偶联物，抗体为半胱氨酸定点插入抗体，半胱氨酸插入位点包含选自以下3个插入位点的一个或多个位点：kappa/λ轻链恒定区第205位(Kabat编号)，轻链恒定区第206位(Kabat编号)或IgG抗体重链恒定区第439位(Kabat编号)。半胱氨酸插入位点氨基酸序列包含以下3个序列的一个或多个：LC-205ins:GLSSPCVTKSF；LC-206ins:GLSSPVCTKSF或HC-439ins:TQKSLSCLSPGK。高活性细胞毒素通过连接子与插入的半胱氨酸游离巯基(-SH)进行定点偶联，连接子与插入的半胱氨酸偶联的抗体轻链氨基酸序列为：GLSSPCVTKSF和GLSSPVCTKSF，连接子与插入的半胱氨酸偶联的抗体重链氨基酸序列为：TQKSLSCLSPGK，其中，C为目标抗体轻链205位或206位或重链第439位插入的半胱氨酸。作为优选，其中所述抗体轻链包括kappa或λ同种型。作为优选，其中所述抗体重链包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。作为优选，其中所述半胱氨酸包含巯基(-SH)。作为优选，其中巯基(-SH)能够进行化学偶联。作为优选，通过连接子与半胱氨酸插入突变的游离巯基进行定点偶联的小分子高活性细胞毒素包括但不限于MMAE、MMAF、PBD、SN-38、Dox及其类似物，MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox分子式为：主要定点偶联步骤为：首先使用还原剂(如DTT、TCEP等)还原抗体，解除抗体上改造的半胱氨酸残基上的屏蔽，并通过阳离子交换层析或超滤换液等方式去除DTT与屏蔽物，然后使用氧化剂(如DHAA、CuSO4等)氧化抗体，使抗体的链间二硫键重新连接。最后加入Linker-drug与胱氨酸残基上的游离巯基偶联，并通过阳离子交换层析或超滤换液等方式去除未偶联上抗体分子Linker-drug。本专利技术氨基酸简表：中文名称英文名称符号与缩写丙氨酸AlanineA或Ala精氨酸ArginineR或Arg天冬酰胺AsparagineN或Asn天冬氨酸AsparticacidD或Asp半胱氨酸CysteineC或Cys谷氨酰胺GlutamineQ或Gln谷氨酸GlutamicacidE或Glu甘氨酸GlycineG或Gly组氨酸HistidineH或His异亮氨酸IsoleucineI或Ile亮氨酸LeucineL或Leu赖氨酸LysineK或Lys蛋氨酸MethionineM或Met苯丙氨酸PhenylalanineF或Phe脯氨酸ProlineP或Pro丝氨酸SerineS或Ser苏氨酸ThreonineT或Thr色氨酸TryptophanW或Trp酪氨酸TyrosineY或Tyr缬氨酸ValineV或ValSEQIDNO:6LC-Cys205ins轻链恒定区(Kappa)氨基酸序列>LC-Cys205ins-KappaTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCVTKSFNRGEC其中，GLSSPCVTKSFN序列中标示出的C为定点偶联位点，与mc-vc-PAB-payload进行定点偶联。SEQIDNO:8LC-Cys206ins轻链恒定区(Kappa)氨基酸序列>LC-Cys206ins-KappaTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVCTKSFNRGEC其中，GLSSPVCTKSFN序列中标示出的C为定点偶联位点，与mc-vc-PAB-payload进行定点偶联。SEQIDNO:10IgG1-Fc-Cys439ins重链恒定区(Fc)氨基酸序列>IgG1-Fc-Cys439insASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSCLSPGK其中，TQKSLSCLSPGK序列中标示出的C为定点偶联位点，与mc-vc-PAB-payload进行定点偶联。SEQIDNO:12LC-V205C轻链恒定区(Kappa)氨基酸序列>LC-V205C-KappaTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC其中，GLSSPCTKSFN序列中标示出的C为定点偶联位点，与mc-vc-PAB-payload进行定点偶联。本专利技术披露的全新半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)相较非定点偶联的ADC具有药物均一性好，副作用小等优点，临床前研究结果显示其显著优于非定点偶联ADC。附图说明图1为实施例25中HIC-HPLC检测2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE的结果图。图2为实施例25中HIC-HPLC检测2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE的结果图。图3为实施例25中HIC-HPLC检测2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE的结果图。图4为实施例25本文档来自技高网...

【技术保护点】
半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物，其特征在于：抗体为半胱氨酸定点插入抗体，所述半胱氨酸插入位点包含选自以下3个插入位点的一个或多个位点：kappa/λ轻链恒定区Kabat编号第205位、轻链恒定区Kabat编号第206或IgG抗体重链恒定区Kabat编号第439位。

【技术特征摘要】
2016.10.08 CN 20161087656891.半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：抗体为半胱氨酸定点插入抗体，所述半胱氨酸插入位点包含选自以下3个插入位点的一个或多个位点：kappa/λ轻链恒定区Kabat编号第205位、轻链恒定区Kabat编号第206或IgG抗体重链恒定区Kabat编号第439位。2.如权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：所述半胱氨酸插入位点氨基酸序列包含以下3个序列的一个或多个：LC-205ins:GLSSPCVTKSF、LC-206ins:GLSSPVCTKSF或HC-439ins:TQKSLSCLSPGK，其中，C为目标抗体轻链205位或206位或重链第439位插入的半胱氨酸。3.如权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：高活性细胞毒素通过连接子与插入的半胱氨酸游离巯基进行定点偶联，连接子与插入的半胱氨酸偶联的抗体轻链氨基酸序列为：GLSSPCVTKSF和GLSSPVCTKSF；连接子与插入的半胱氨酸偶联的抗体重链氨基酸序列为：TQKSLSCLSPGK；其中，C为目标抗体轻链205位或206...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱义，王一茜，卓识，李杰，陈澜，万维李，余永国，
申请(专利权)人：四川百利药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川,51