复合扩增STR的引物设计方法技术

一种复合扩增ＳＴＲ的引物设计方法，其特征是按以下方式进行：ａ、分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物Ｐ１、Ｐ２的５′端加上一段非人类的基因组序列：ＹＰＡ（５′－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′）ＹＰＢ（５′－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ－３′），从而得到长引物ＹＰＡ－Ｐ１和ＹＰＢ－Ｐ２，以此作为复合扩增过程中第一阶段聚合酶链反应的引物对；ｂ、直接以非人类的基因组序列：ＹＰＡ（５′－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′）ＹＰＢ（５′－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ－３′）作为复合扩增第二阶段聚合酶链反应的引物对。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种体外一次性扩增多个DNA目的片段的引物设计方法。
技术介绍
人体细胞核内的脱氧核糖核苷酸(DNA)是遗传信息的携带者，它是由两条核酸长链形成的双螺旋结构。每一条核苷酸长链上有脱氧核苷酸单位(dNTP)，A、T、G、C是它们的碱基。上述碱基的排列控制了遗传信息(如身高，体重，智力等)的表达。两条核酸长链以氢键结合，且以碱基配对互补为原则，即A-T，G-C；互补的双链有方向，一条是从5′→3′端，互补的另一条链是从3′→5′端。当体细胞分裂时，生物体内DNA进行复制，双螺旋结构在一些特定酶的作用下解开，形成两股单链，各自作为模板，用于合成新的互补链。上述过程需要DNA聚合酶的作用，且它沿母链的5′→3′的方向催化DNA分子合成新链。子代细胞出现的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整的接受过来，另一股单链完全重新合成，且与母链按碱基配对原则互补。但在体外DNA合成的化学反应中，DNA聚合酶只能在一段DNA片段结合到模板上后，才能催化DNA的合成，不能从头开始复制，而这一段DNA片段就是我们所说的引物。故在体外DNA合成时，需要有一段引物，DNA聚合酶才能进行体外复制DNA。在人类基因组或其他生物基因组中一些DNA片段是我们需要的目的片段，为了使其大量扩增，现在采用了一种叫做聚合酶链式反应(PCR反应)的技术，体外扩增所需的目的片段。在进行PCR反应时，首先应按照欲检测的DNA片段的两个3′端的碱基顺序各自合成一段长约17-20余个碱基的寡核苷酸片段作为引物(primer)。PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促反应，扩增的特异性取决于引物与模板的特异结合。整个扩增过程分三步(1)变性加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；(2)退火突然变温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单等特点，主要的结合发生在模板与引物之间；(3)延伸在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。上述三步为一循环，从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。PCR反应虽然是一种体外扩增DNA的有效方法，但它通常是指在一个反应体系中一次性的扩增一个目的DNA片段。在实际工作中，人们往往希望在一个反应体系中一次性的扩增多个目的DNA片段，因此便产生了复合扩增方法。从前述PCR反应的机理可以看出，为了实现复合扩增反应，就必须针对同一反应体系中的各个目的DNA片段设计引物对。目前常用的方法是将要复合的几个目的基因座的引物对加在一起，直接进行复合扩增，例如韩国人Murim Choi等在《Internetional Journal Legal Medicine》2000年第113期中发表的《Frequency data on four tetrameric STR loci D18S1270，D14S608，D16S3253 and D21S1437 in a Korean population》文章中所介绍的方法。在此种复合扩增方法中，由于各对引物所对应扩增产物的量并不一致，所以就必须调整各对引物之间的相对浓度，各引物之间还要发生反应与竞争，从而大大降低了PCR扩增的效率。同时，还需对反应体系中的其它反应成份进行调整，整个实验过程比较繁琐，且结果的可重现性很差。另外，现在国外的某些公司开发了用于复合扩增反应的试剂盒，他们并未公开试剂盒的具体原理和方法，国内外的大多数生物学实验室则利用这些试剂盒直接进行复合扩增反应。在实验过程中，他们利用的是荧光标记引物，用DNA测序仪，如ABI 310测序仪直接检测结果。例如，Xie Xiaodong等在《Internetional Journal Legal Medicine》2001年第114期中发表的《Tibetan population data on the PCR-typed loci D16S539，D7S820，D13S317，HUMF13A01，FESFPS，vWA，HUMTH01，TPOX and CSF1PO》文章中所介绍的即是这种方法。此外，Jannine Brownie等人在《Nucleic AcidsResearch》1997年第25卷16期中发表的《Tne elimination of primer-dimeraccumulation in PCR》文章中提到了在原引物的5′端加入一段序列的引物设计方法，用于复合扩增反应，这一方法值得借鉴和改良。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种扩增效率高、便于实验室操作和便于检测扩增效果的复合扩增的引物设计方法，尤其是一种STR(短串联重复多态性)引物的设计方法。本专利技术方法的基本思路是选取一对非人类基因组的短DNA片段作为短引物对YPA和YPB，并在能与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端分别加上该对短引物，从而得到长引物YPA-P1和YPB-P2。此处，能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2亦即是可以与待扩增基因座的人类基因组结合的原始引物。由于复合扩增反应是同时对多个基因座进行的PCR扩增，相对于不同基因座来说，能够与该基因座的人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2是不同的，与之相对应，各个待扩增基因座的长引物YPA-P1和YPB-P2也因P1、P2的不同而不相同。在进行复合扩增反应时，同时在PCR反应体系中加入上述短引物和针对不同待扩增基因座的长引物(当然还需加入常规PCR反应所需的耐热聚合酶和单核苷酸等)。由于各个待扩增基因座的人类基因组序列中并不含有短引物YPA、YPB所对应的序列，所以在该反应体系进行第一轮PCR反应时(经历前述变性、退火、延伸的一次循环过程)，短引物YPA、YPB并不会与人类基因组序列结合，所扩增的DNA片段还是由长引物YPA-P1、YPB-P2中所含的原来的引物对P1、P2所决定。但是，第一轮反应结束后，在待扩增基因座将会产生同时具有目的基因片段和非人类基因组序列YPA、YPB的扩增产物。在PCR反应体系进行第二轮PCR反应(即经历变性、退火、延伸的第二次循环过程)时，上述同时具有目的基因片段和非人类基因组序列YPA、YPB的产物被进一步扩增，扩增所用引物仍然是长引物YPA-P1、YPB-P2，反应完成后，所得到的产物同时具有目的基因片段和与短引物对YPA、YPB配对的非人类基因组序列。在本专利技术中，我们将上述以长引物作为反应引物的第一轮和第二轮PCR反应称之为第一阶段的反应，即复合扩增过程中第一阶段的聚合酶链反应。换句话说，复合扩增过程中第一阶段的聚合酶链反应包括了上述第一轮和第二轮反应。该阶段反应所得到的扩增产物同时具有目的基因片段和与短引物对(YPA、YPB)配对的非人类基因组序列，此处将其称之为复合扩增第一阶段的产物。从第三轮PCR反应开始，由于对于各个基因座已经具有上述第一阶段的产物，这样，短引物YPA、YPB就可以作为上述各本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合扩增ＳＴＲ的引物设计方法，其特征是按以下方式进行：ａ、分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物Ｐ１、Ｐ２的５′端加上一段非人类的基因组序列：ＹＰＡ（５′－－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′） ＹＰＢ（５′－－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ－３′），从而得到长引物ＹＰＡ－Ｐ１和ＹＰＢ－Ｐ２，以此作为复合扩增过程中第一阶段聚合酶链反应的引物对，即长引物对；ｂ、直接以非人类的基因组序列：ＹＰＡ（５′－－Ａ ＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′）ＹＰＢ（５′－－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ－３′）作为复合扩增第二阶段聚合酶链反应的引物对，即短引物对。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯一平，李英碧，应斌武，冀强，董建国，吴谨，张霁，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]