家畜用去势疫苗ＬＨＲＨ基因，其具体的基因序列如下： ５′－ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＴＧＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＴ ＮｃｏⅠ ＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡ－３′ 终止子 ＸｈｏⅠ。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术动物去势疫苗基因及重组基因载体，用于生产家畜家禽去势用促黄体素释放激素(LHRH)基因工程亚单位疫苗，属于生物技术高科技领域。(二)技术背景促黄体素释放激素(Luteinizing hormore releasing hormore，LHRH)是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素，其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(LH)及促卵泡激素(FSH)，这些激素能促进性腺及性器官的正常发育，维持动物的生殖功能。去势疫苗可免疫调控动物内分泌系统的性相关激素水平，抑制动物性器官发育，使动物丧失性行为和性功能，从而防止混乱交配(引起畜群退化)和争斗，促进动物生长，改善胴体组成和肉质(使肉质鲜嫩并防止膻味)，提高饲料报酬。其机理是通过LHRH合成抗原或重组抗原作疫苗免疫动物后，在体内形成LHRH抗体，中和内源性LHRH，从而显著降低睾酮及雌激素等性激素水平，达到温和去势的目的。与传统手术去势相比，疫苗去势不仅简便易行，给管理上带来极大的方便，尤其适合于规模化养殖和放牧畜群，而且可防止手术去势导致的出血、感染及应激造成的减食和体重下降，另外疫苗去势可适用于大动物或小动物(鸡等小动物手术较困难)、雌性或雄性动物、幼龄和成年动物、畜禽和其他动物，再者疫苗去势可通过配套技术实现可逆性控制。通过免疫方法促使动物产生抗LHRH的抗体，以中和LHRH的生理作用，从而抑制性腺的发育以达到去势的目的，其可行性已被国内外许多学者证实，但大多数研究都集中在合成肽疫苗，虽然免疫效果显著，终因成本太高而无法进入实际应用。王彩平等将LHRH/HBsAg融合蛋白在家蚕杆状病毒中进行表达，但也因表达产量低，提纯工艺繁琐而未能推广应用。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是设计动物去势疫苗基因，构建能高效表达LHRH融合蛋白的动物去势疫苗重组基因载体，可以用于研制高产、优质、高效、低成本、工艺简便，适合规模生产、使用方便，而且安全性高，无残留，无潜在危险的动物去势基因工程疫苗，免疫动物，替代传统的手术去势。技术方案 本专利技术所提供的动物去势疫苗基因，其通式为5′--保护性碱基--限制性酶切位点--框架保证碱基--LHRH基因--终止子--限制性酶切位点--保护性碱基--3′其中，保护性碱基可以是A、T、G、C任选；限制性酶切位点是指Nco I、EcoR I、HindIII、Xho I、BamH I等限制性酶的切点；框架保证碱基可以是A、T、G、C任选；LHRH基因是指家畜LHRH基因，或者是家禽LHRH基因，或者是LHRH基因和家禽LHRH基因串联。上述动物去势疫苗基因，例举具体的基因序列如下家畜用去势疫苗LHRH基因序列——L15′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′终止子Xho I家禽用去势疫苗LHRH基因序列——L25′-GGCCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTNco ITAATGAACTCGAGCA-3′终止子 Xho I畜/禽通用去势疫苗LHRH基因序列之1——L35′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNco IGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′终止子 Xho I畜/禽通用去势疫苗LHRH基因序列之2——L45′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNco IGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′终止子 Xho I用上述动物去势疫苗基因构建的重组基因载体，pET-32c LHRHn-N/X重组表达质粒，是通过以下方法构建获得的1.LHRH基因片段的退火将人工合成的动物去势疫苗基因片段的正链和负链，分别用灭菌超纯水溶解成浓度为100pmol/μl(相当于1.82μg/μl)的溶液，各取2μl加入72μl超纯净水中混匀，置沸水浴中2min后缓慢冷却至室温，-20℃冻存备用；2.LHRH基因的酶切用NcoI及XhoI对退火后的LHRH基因进行双酶切，酶切产物直接用于连接反应；3.pET-32c质粒的提取、酶切及回收pET-32c质粒的提取后，用NcoI及XcoI对pET-32c质粒进行双酶切。取10μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切大片段，置液氮中冻5min，而后置37℃水浴中融化，10000r/min离心10min，吸取上清-20℃冻存备用；4.连接DNA连接反应体系如下PET-32c双酶切回收产物 2.5μlLHRH基因酶切产物 7.5μlDNA Ligation Kit Solution I 10μl上述混合物16℃反应30min后立即用于转化；5.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备；6.转化取10μl连接产物转化200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，取200μl转化产物涂布含Amp 50μg/ml的LB琼脂平板，平板置37℃温箱中培养18小时，挑取转化后的单个菌落，接种含Amp的LB肉汤扩大培养后提取质粒，即为重组基因载体pET-32c LHRHn-N/X重组质粒。有益效果 本专利技术所提供的动物去势疫苗基因及其重组基因载体，可高效表达LHRH-Trx融合蛋白(表达量30％以上)，用于生产家畜家禽去势用促黄体素释放激素(LHRH)基因工程亚单位疫苗。由于鸟类和哺乳动物的LHRH有一个氨基酸不同，分别构建了表达鸟类、哺乳类及不同数量鸟类/哺乳类相间串联的LHRH基因的重组表达质粒(Ll、L2、L3、L4)。经检验测试，本专利技术所提供的重组基因载体，在表达量、免疫原性、生产简便性、去势有效性、安全性、成本等各方面均符合产业化要求。用其制造疫苗，生产简易，成本低廉，安全有效。4种质粒中，L1表达产物对家畜有效，L2对家禽有效，L3及L4家畜家禽通用，L4免疫产生期及免疫持续期等方面的效力又优于L3，可根据各种不同的应用需要加以选择。采用该工程体在实验室条件下生产L1、L2、L3和L4苗样各3批，其表达产量稳定，表达产物蛋白量均达菌体总蛋白量的30％以上。表达产物均稳定具有良好的免疫原性，表现在(1)表达产物与Sigma公司的LHRH标准抗体发生特异性反应；(2)免疫动物后能有效激发产生高效价的LHRH抗体，该抗体能在体外试验中与LHRH发生特异性反应。共免疫小鼠210只，兔50只，土鸡30只，猪640头，猫6只，狗4只，免疫动物后均能有效激发抗体，性成熟期观测，在性行为、性功能、性激素水平、性器官发育抑制本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吉传义，杜念兴，朱杰青，龚光明，王凌，龚晓明，
申请(专利权)人：成都瑞盛高科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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