纤维蛋白溶解系统激活蛋白技术方案

本发明专利技术提供了一种纤维蛋白溶解系统激活蛋白，其是：１）ＳＥＱ?ＩＤＮｏ．２所示氨基酸序列组成的蛋白质；或，２）ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ．２所示氨基酸序列经取代、缺失和／或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由１）衍生的蛋白质。实验表明，该蛋白能够明显增强体内纤溶作用、促进血栓溶解，对血液流变学指标有明显改善，而且不影响凝血系统和抗凝指标，其是一种理想的用于治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍的药物。本发明专利技术具有广阔的应用前景，具有良好的经济价值和社会效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物药物领域，具体涉及一种能够激活纤维蛋白溶解系统的蛋白质， 该蛋白能够用于治疗和预防与血栓生成及微循环障碍有关疾病。
技术介绍
本世纪八十年代未九十年代初出现全球性的老年社会，而危害中老年人生命的第 一杀手就是心脑血管疾病。据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年约有1200万人死于心 脑血管疾病。中国中风发病率约219/10万，患病率为761/10万，全国约有900万人患有中 风，在发病人数中约有2/3为缺血性中风，其血栓的形成是导致缺血性中风和其它一些心 脑血管疾病的主要原因，据分析从八十年代初至九十年代初十年间，由于我国人在饮食结 构、体力活动强度和其他工作生活条件的较大变化，按过去十年有关心脑血管发病因素的 增长；情况，有关专家保守的估计，到二十一世纪初，我国中风发病率将上升60%，冠心病 发病率将上升80%。为此，科学家为寻求治疗血栓疾病的药物付出了极大的努力。目前应用于治疗血 栓疾病主要有链激酶、尿激酶、蛇毒蛋白、t-PA。但是距离人类抵抗这类疾病的要求还远远 不够。1986年，日本科学家美源恒首次应用现代生物技术方法提取蚯蚓中溶栓活性成 分。确认口服蚯蚓粗蛋白提取物对血栓溶解、预防血栓形成以及降低血液粘度等方面有效。 并且分离了六种蛋白酶组分，申请了专利一US 4，568，545。认为血栓溶解的活性组分就 是这六个组分其中之一或几个的组合。这六个蛋白酶组分分别是F-0-HM-45 分子量24，500 士 2，000 道尔顿F-I-1-HM-54 分子量27，500士2，000 道尔顿F-I-2-HM-15 分子量27，000士2，000 道尔顿F-II-HM-64 分子量27，800士2，000 道尔顿F-III-1-HM-27 分子量32，400士2，000 道尔顿F-III-2-HM-89 分子量32，800士2，000 道尔顿在此基础上，我国科学家在90年代初推出了蚯蚓粗蛋白提取物口服溶栓胶囊，目 前在我国有多家大型制药企业生产该类药物，如“江中制药”的“博洛克”、“青岛双龙”的“普因官，，坐坐 思反 寸寸。CN 1393453A公开了 一种血纤维蛋白溶解系统激活蛋白(fibrinolysis activating protein, FAP)分子量为16. 2kDa，其具有一定的溶解血栓活性。在此之后，对蚯蚓中溶栓活性有效组分的确定方面有大量的研究工作。但是，蚯蚓 中溶栓活性组分的最终确定的研究一直没有进一步的进展。使蚯蚓的药用功能进一步应用 受到限制。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种新的纤维蛋白溶解系统激活蛋白(FAP)。本专利技术的第二个目的在于提供编码上述纤维蛋白溶解系统激活蛋白的基因。本专利技术的再一个目的还在于提供上述纤维蛋白溶解系统激活蛋白的用途。本专利技术从蚯蚓(Lumbricidae)中分离得到一种新的蛋白质，研究表明，该蛋白质 没有直接降解纤维蛋白活力，但在体内有明显增强体内纤溶作用、促进血栓溶解；对血液流 变学指标有明显改善；而且不影响凝血系统和抗凝指标。通过提取的蚯蚓全RNA为模版，按照该蛋白质N端氨基酸序对应的mRNA5’端基因 序列和所有mRNA共有的3’端polyA序列设计引物，经RT-PCR反应，获得该蛋白质的cDNA， 其核苷酸序列如SEQID No. 1所示，编码52个氨基酸所组成的蛋白质。经测定，该蛋白质的 氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。应当理解，本领域技术人员可根据本专利技术公开的氨基酸序列，在不影响其活性的 前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如，将第14 位的Glu替换为Asp，将第20位的Gin替换为Asn，或者将最后一位氨基酸缺失，或者在N 端增加氨基酸。因此，本专利技术蛋白还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或 添加一个或几个氨基酸，具有同等功能的由SEQID No. 2组成的蛋白衍生得到的蛋白质。本 专利技术还包括编码上述蛋白的基因。上述衍生得到的蛋白质，包括但不限于1)截短的蛋白质或者多肽，其中从FAP的一端或两端或蛋白质的内部区域除去一 个或多个氨基酸，而产生的分子仍然保持原有的活性。2)加长了的蛋白质或多肽。其中在FAP蛋白质的一端或两至或中间位置加入一个 或多个氨基酸，而产生的分子仍保持着原有的活性。3)氨基酸残基经取代的蛋白质或多肽，包括其它分子(包括但不限于天然和非天然存 在的氨基酸)在特异性位点发生的氨基酸的取代，这种取代后的分子仍然保持着原有的活性。此外，本专利技术纤维蛋白溶解系统激活蛋白还包括上述蛋白质经修饰的衍生物，包 括使用化学方法将FAP与其它分子结合。包括基于可以存在于氨基酸上的功能基团(氨基、 巯基、羧基，酰胺、苯酚、咪唑)选择所说的结合技术。其它的对这些基团结合有效的各种试 剂包括戊二醛、重氮化联苯胺、碳二亚胺和对苯醌。将FAP与同位素、酶、载体蛋白质、细胞 毒性剂、荧光分子和其它具有多种用途的化合物通过化学方法结合。这些结合技术对本领 域技术人员是公知的。此外，还可以通过对本专利技术纤维蛋白溶解系统激活蛋白进行修饰，或取代、缺失和 /或添加一个或几个氨基酸获得该蛋白的衍生物，该衍生物够专一性结合所述纤维蛋白溶 解系统激活蛋白受体，但不具备激活纤维蛋白溶解系统的功能。从而，这种衍生物可以作为 血纤维蛋白溶解系统抑制剂进行使用。当然，这种衍生物可以改变FAP的生物活性和产生 生物或者药理上的激活剂或者抑制剂(如经修饰后，蛋白质保持它的专一性，其活性丧失， 被用于抑制FAP的目标物活性)。纤维蛋白溶解系统激活蛋白(FAP)来源于蚯蚓中分离纯化所得，包括步骤将 蚯蚓勻浆后，用硫酸铵分级盐析，取50 %硫酸铵盐析沉淀，透析过夜，离心取上清，依次用 Sephadex G100凝胶层析柱、DEAE-Sepharose离子交换色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化得到活力组分。在获知FAP的氨基酸序列SEQ ID No :2后可以来源于其他许多途径。 包括来源于重组微生物表达；来源于植入相关基因遗传上改变的动物或植物；来源于基因 重组的细胞、肿瘤、细胞培养物以及其它生物途径；来源于酶促切割不同的分子(包括包含 FAP片段同源或者等同性序列的前体；来源于化学(肽化学合成和体外酶催化前体分子) 方法产生的FAP。例如在重组大肠杆菌、昆虫、酵母以及其它表达系统中产生FAP，并用柱层 析进行纯化。在本专利技术实施例中将编码FAP的基因导入表达载体，进而转化宿主细胞，通过 培养、诱导表达，最后分离纯化获得FAP。可以用在特定位置的氨基酸取代，进行这些肽片段的合成以便体外和体内检测激 活和抑制活性。可以使用与组织具有高度亲和性的肽片段在亲和性柱上分离FAP目标物。 对于阐明FAP活性机理，FAP目标物的分离和纯化是根本步骤，这种方法有利于产生调节 FAP目标物活性的药物。最终产生生物活性。这种目标物的分离使得可以构建使用原位和 溶液杂交技术监测目标物位置及合成的核苷酸探针。FAP的合成肽片段具有多种功能。将与FAP目标物以高度特异性和亲合力结合的 肽进行放射性或其他化学标记，可用于定量结合物及显现结合位置。本专利技术提供了重要诊 断和研究工具。FAP目标物的定量和位本文档来自技高网...

【技术保护点】
纤维蛋白溶解系统激活蛋白，其是：１）ＳＥＱＩＤＮｏ．２所示氨基酸序列组成的蛋白质；或，２）ＳＥＱＩＤＮｏ．２所示氨基酸序列经取代、缺失和／或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由１）衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张益民，王凌，
申请(专利权)人：成都瑞盛高科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]