特异性靶向TIM‑3基因的sgRNA和特异性敲除TIM‑3基因的方法技术

本发明专利技术基于CRISPR系统，提供了一种特异性靶向人‑TIM3基因的sgRNAs和特异性敲除人类细胞中TIM‑3基因的方法。利用本发明专利技术提供的sgRNA能够精确有效的靶向人TIM‑3基因并实现基因的精准敲除，具有效率高、周期短、成本低的优异特性。所述方法能够用于制备TIM‑3免疫检查点敲除的人类T细胞，进而将其用于肿瘤免疫治疗。

Methods targeting TIM 3 gene sgRNA and specific gene knockout TIM 3

【技术实现步骤摘要】
特异性靶向TIM-3基因的sgRNA和特异性敲除TIM-3基因的方法
本专利技术属于基因工程领域，其涉及利用CRISPR-Cas9系统对细胞，尤其是T细胞进行基因编辑的方法，具体为利用CRISPR-Cas9特异性敲除人T细胞中的TIM-3基因的方法。
技术介绍
免疫检查点是一系列的免疫抑制分子。正常情况下，免疫检查点对于维持自身免疫耐受、避免免疫系统在对抗病原性感染时对自身器官的攻击起到重要作用，而多种癌症正是通过免疫检查点蛋白表达失调来实现免疫逃避的。通过阻断免疫检查点，恢复机体自身抗肿瘤免疫应答，借助机体免疫功能来清除体内癌细胞一直是肿瘤学家和肿瘤患者的梦想。目前，在癌症免疫治疗中最重要、研究最多的两个免疫检查点分子是T淋巴细胞抗原-4(cytotoxicT-lymphocyteantigen-4，CTLA-4)和程序性死亡-1(programmeddeath-1，PD-1)。LAG-3、TIM-3、LAG-3H(VISTA)、BTLA、CD160、2B4、LAIR1、TIGIT、KIRs等免疫检查点也逐渐成为肿瘤免疫治疗所关注的重点对象，相继有多种针对上述靶点的抗体药物处于临床本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于CRISPR特异性靶向人TIM‑3基因的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA依照下述原则设计：(1)a.基于Cas9，在人TIM‑3基因上选择5’‑N(21)GG或者5’‑N(21)AG；或，b.基于Cpf1，在TIM‑3基因上选择5’TTTN(20)序列；(2)sgRNA在靶基因上的靶向位点或者剪切位点位于基因的外显子；(3)sgRNA在靶基因上的靶向位点或者剪切位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上；(4)在UCSC数据库中用Blat或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一；优选的，所述基于Cas9的sgRNA的序列如SEQ ID NO.302‑430所示；更...

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR特异性靶向人TIM-3基因的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA依照下述原则设计：(1)a.基于Cas9，在人TIM-3基因上选择5’-N(21)GG或者5’-N(21)AG；或，b.基于Cpf1，在TIM-3基因上选择5’TTTN(20)序列；(2)sgRNA在靶基因上的靶向位点或者剪切位点位于基因的外显子；(3)sgRNA在靶基因上的靶向位点或者剪切位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上；(4)在UCSC数据库中用Blat或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一；优选的，所述基于Cas9的sgRNA的序列如SEQIDNO.302-430所示；更优选的，所述基于Cas9的sgRNA的序列如SEQIDNO.503-707、310、312、313所示；优选的，所述基于Cpf1的sgRNA的序列如SEQIDNO.431-467所示；更优选的，所述基于Cpf1的sgRNA的序列如SEQIDNO.431-436所示。2.一种基因编辑载体，其特征在于，包含权利要求1所述sgRNA；优选的，权利要求1所述sgRNA连接于初始载体PMH001-Cas9或PMH002-Cpf1，所述PMH001-Cas9的核苷酸序列如SEQIDNO.478所示，所述PMH002-Cpf1的核苷酸序列如SEQIDNO.479所示。3.一种基因重组病毒颗粒，其特征在于，所述病毒颗粒包含权利要求1所述sgRNA或权利要求2所述载体；所述病毒可选自逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺相关病毒中的一种或几种。4.一种基于CRISPR系统特异性敲除人TIM-3基因的方法，其特征在于，包含如下步骤：1)基于Cas9或Cp...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘波，任子男，闫威，黄园园，
申请(专利权)人：北京微旋基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11