干扰Hsa‑miR‑449a表达的试剂及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，涉及干扰Hsa‑miR‑449a表达的试剂及其应用，主要涉及在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中的应用。促进肝癌干细胞自我更新的癌基因Hsa‑miR‑449a，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术首次公开了Hsa‑miR‑449a在肝癌干细胞中表达并且对于维持肝癌干细胞自我更新至关重要。Hsa‑miR‑449a基因在抑制肝癌干细胞自我更新中的应用，是通过干扰Hsa‑miR‑449a在肝癌干细胞中的表达来抑制肝癌干细胞自我更新。干扰Hsa‑miR‑449a的表达试剂可以制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物，用于靶向治疗肝癌，对延长肝癌生存时间具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
干扰Hsa-miR-449a表达的试剂及其应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及干扰Hsa-miR-449a表达的试剂及其应用，尤其涉及在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中的应用。
技术介绍
肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制尚未明确，目前对于肝癌的治疗并不理想，术后的复发和转移仍是亟待解决的一大难题。近年来的研究使肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)的概念深入人心，越来越多的证据表明肿瘤干细胞与肿瘤的生长、耐药、复发和转移等密切相关。迄今为止，已在血液系统肿瘤及脑胶质瘤、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等30余种常见肿瘤中证实了肿瘤干细胞的存在。但是关于肿瘤干细胞内部的调控机制目前并不清楚，是否可以利用针对肿瘤干细胞调控分子的抑制剂来辅助肿瘤治疗也未有明确报道。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种长度约为22～28个核苷酸的非编码RNA，它们通过mRNA介导的特异性的基因沉默导致靶mRNA降解及抑制蛋白质的合成，调控转录后基因表达水平，影响细胞增殖、分化和凋亡。近年来，miRNA介导的转录后基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)与肿瘤形成的相关性已成为关注的热点。肿瘤细胞与正常组织细胞miRNA表达谱有显著差异，miRNA在肿瘤形成过程中可能扮演着重要的角色。Hsa-miR-449a是肿瘤研究中新近兴起的一种miRNA，在前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤中存在异常表达，可能与肿瘤的发生和发展过程密切相关，研究其功能及调控机制，可为肿瘤诊断、治疗和预后判断提供重要线索。shRNA又称“短发夹RNA”，克隆到shRNA表达载体中，在细胞内该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA)，并被RNAi通道处理，诱导实现靶mRNA的降解。
技术实现思路
综合现有技术的分析，Hsa-miR-449a目前认为其为抑癌基因可以阻断肿瘤的发生发展，但是专利技术人在研究过程中意外发现Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中高表达提示其可能在肝癌干细胞中作为癌基因，促进肝癌的发生发展，而目前并没有学者研究Hsa-miR-449a在干细胞中的作用，更没有关于Hsa-miR-449a是癌基因的报道，专利技术人的研究打破了传统的关于Hsa-miR-449a的学术理论，进一步，专利技术人提供了Hsa-miR-449a新的功能和用途，以及一种干扰Hsa-miR-449a表达的试剂及该试剂在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中的应用。有鉴于此，本专利技术的目的首先在于提出Hsa-miR-449a新的功能及应用。其次，本专利技术的目的在于提供一种干扰Hsa-miR-449a表达的试剂及应用，为肝癌的基因治疗提供新靶点。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：促进肝癌干细胞自我更新的癌基因Hsa-miR-449a，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。Hsa-miR-449a目前认为其为抑癌基因可以阻断肿瘤的发生发展，但是专利技术人在研究过程中意外发现Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中表达可以作为癌基因，促进肝癌的发生发展。进一步，本专利技术提供了Hsa-miR-449a的新用途。Hsa-miR-449a基因在抑制肝癌干细胞自我更新中的应用，是通过干扰Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中的表达来抑制肝癌干细胞自我更新。目前并没有学者研究Hsa-miR-449a在干细胞中的作用，更没有关于Hsa-miR-449a是癌基因的报道，专利技术人的研究打破了传统的关于Hsa-miR-449a的学术理论，提供了Hsa-miR-449a新的功能和用途。抑制肝癌干细胞自我更新的药物，所述药物能干扰Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中的表达。进一步，所述的药物为包含干扰Hsa-miR-449a基因表达的核酸序列。进一步，所述干扰Hsa-miR-449a基因表达的核酸序列为利用SEQIDNO:1所示序列设计的shRNA。进一步，所述shRNA为sh-miR449a，所述sh-miR449a的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。专利技术人进一步提供了干扰Hsa-miR-449a表达的试剂及其应用。干扰Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中表达的试剂。进一步，所述试剂为质粒pLv-sh-miR449a。优选的，所述试剂为含有质粒pLv-sh-miR449a的表达载体。优选的，所述试剂为含有质粒pLv-sh-miR449a的转基因细胞系。优选的，所述试剂为含有质粒pLv-sh-miR449a的宿主菌。优选的，所述试剂为含有质粒pLv-sh-miR449a的慢病毒。进一步，所述慢病毒由pLv-sh-miR449a质粒转染细胞后，经包装、纯化所得。优选的，所述慢病毒由pLv-sh-miR449a质粒转染HEK293T细胞后，经包装、纯化所得。本专利技术所述的干扰Hsa-miR-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中应用。进一步，干扰Hsa-miR-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞增殖的药物中的应用。进一步，干扰Hsa-miR-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞克隆形成的药物中的应用。进一步，干扰Hsa-miR-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞成球的药物中的应用。进一步，干扰Hsa-miR-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞皮下移植瘤形成的药物中的应用。本专利技术最后还提供了一种干扰Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中表达的方法，包括如下进行的步骤：(1)将慢病毒表达质粒pLv-sh-449a转染宿主细胞，经包装、纯化得到含有质粒pLv-sh-miR449a的慢病毒；(2)取步骤(1)得到的慢病毒接种感染肝癌干细胞。本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术首次公开了Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中表达并且对于维持肝癌干细胞自我更新至关重要。2)本专利技术提供了Hsa-miR-449a基因的新用途，Hsa-miR-449a基因在抑制肝癌干细胞自我更新中的应用，是通过干扰Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中的表达来抑制肝癌干细胞自我更新。3)本专利技术提供了干扰Hsa-miR-449a表达的试剂，干扰Hsa-miR-449a的表达试剂可以制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物，用于靶向治疗肝癌，对延长肝癌生存时间具有重要意义。4)本专利技术提供了一种干扰Hsa-miR-449a表达的方法，该方法能够干扰Hsa-miR-449a的表达，进而抑制肝癌干细胞自我更新，即抑制肝癌干细胞的增殖、克隆形成、成球能力以及皮下移植瘤形成率，延缓体内肿瘤生长。附图说明图1为qRT-PCR检测Hsa-miR-449a分别在成球培养的肝癌细胞(a)、Nanogpos的肝癌干细胞和Nanogneg的非肝癌干细胞(b)及耐药的肝癌细胞(c)中的表达。图2为pLv-sh-miR-449a图谱。图3为Nanogpos的肝癌干细胞中干扰Hsa-miR-449a的表达后，通过qRT-PCR检测Hsa-miR-449a的干扰效率。图4为干扰Hsa-miR-449a的表达后检测克隆形成能力。图5为干扰Hsa-miR-449a的表达后检测成球能力。图6为干扰Hsa-miR-449a的表达后免疫缺陷小鼠NOD/SCID小鼠皮下移本文档来自技高网...

【技术保护点】
促进肝癌干细胞自我更新的癌基因Hsa‑miR‑449a，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.促进肝癌干细胞自我更新的癌基因Hsa-miR-449a，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.Hsa-miR-449a基因在抑制肝癌干细胞自我更新中的应用，其特征在于，是通过干扰Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中的表达来抑制肝癌干细胞自我更新。3.抑制肝癌干细胞自我更新的药物，其特征在于，所述药物能干扰Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中的表达。4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物包含干扰Hsa-miR-449a基因表达的核酸序列。5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述干扰Hsa-miR-449a基因表达的核酸序列为利用SEQIDNO:1所示序列设计的shRNA。6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述shRNA为sh-miR449a，所述sh-miR449a的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。7.干扰Hsa-miR-449a在肝癌干细胞中表达的试剂。8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述试剂为包...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茜真，杨智，徐艳敏，赵文旭，陈军，齐亚男，沈俊杰，钱程，
申请(专利权)人：重庆精准生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50