一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4及其应用，属于水稻生物育种领域。本发明专利技术的目的是提供一种从水稻中克隆到的能够响应稻瘟病菌侵染，可以作为病原诱导型启动子使用的DNA序列片段，该DNA序列片段是水稻P450单加氧化酶基因CYP71Z4(NCBI登录号：Os10g0439800)的转录调控区，其特征是它具有第1位到第1948位的启动子区核苷酸序列。本发明专利技术可以作为病原诱导型启动子使用，或用于其它转基因植物的相关调控序列，培育抗病植物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4及其应用
本专利技术涉及一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4及其应用，属于植物基因工程
具体涉及到一个水稻病原诱导型启动子P71Z4的克隆、功能验证和应用分析。
技术介绍
水稻在生长发育过程中，经常会受到各种病原(包括稻瘟病菌、白叶枯病菌、细菌条斑病菌以及水稻矮缩病毒等)的侵害。在与病原长期相互作用的过程中，水稻已经进化成多种复杂而有效的抗病机制来抵抗病原的侵染。抗病基因的克隆和应用为水稻病害的防治提供了一个经济有效和环境友好的方法。目前，利用转基因技术把抗病基因转入感病水稻栽培品种是改良水稻病害抗性的重要途径。尽管大批的抗病基因被克隆以及应用，但是由于应用于转基因载体的启动子多数属于组成型启动子。这不仅造成了植物体的负担，使植物在不需要发生抗病反应时表达额外的蛋白，造成了浪费，而且严重地还造成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡，使得转基因水稻一生中需要消耗掉大量的能量。这是利用转基因技术防治水稻病害的最明显的一个缺陷。为了解决这个问题，申请者试图利用受病原菌诱导启动子调控目标抗病基因的表达。启动子是位于结构基因上游能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体，且对基因的表达起调控作用的一段DNA序列。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box等核心作用元件。TATA框，又称Hogness框，其一致序列为：TATAAAA或TATATAT，而在它的两侧由富含G和C碱基对的序列组成，一般都位于-35bp附近。TATA框决定了转录起始点的选择，它是RNA聚合酶和DNA链结合的部位。CAAT框，其一致序列为GGC(T)CAATCT。一般位于-75bp附近，该框的碱基一旦缺失或突变，将会造成转录效率的急剧降低，CAAT框可能控制着转录起始的频率。增强子(enhancer)，又称为远上游序列，一般都在-100bp以上，它对依赖和不依赖TATA框的转录均有增强转录的作用。另外，不同的启动子上还有其他不同的顺式(cis)调控元件，它们是反式(trans)调控因子或转录调控蛋白的结合位点。不同的反式调控因子/转录调控蛋白特异性的与顺式调控元件结合，对基因的表达时间，空间或表达量进行特异性的调控。按照功能及作用方式可大致分为组成型表达启动子、组织特异性表达启动子和诱导型表达启动子三大类。正如前文所述，组成型表达启动子在转基因作物中驱使目的基因持续大量表达，浪费作物能量并带来损失，而组织特异性启动子使目的基因在某一组织中特定地表达，可以较好地解决这一方面的问题。目前，诱导型启动子是公认的有较好应用前景的启动子。诱导型的启动子对外界的某些物质，如病原物，化学物质或逆境作出反应，启动植物体内相应的基因表达。因此，利用水稻来源的病原物诱导表达的启动子驱动抗性基因的表达，是改良水稻抗性的最佳选择之一。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一个来自于水稻响应病原菌侵染的启动子P71Z4。本专利技术的另一目的是提供病原菌诱导型启动子的克隆和功能鉴定的方法。本专利技术的又一目的是提供病原菌诱导型启动子的应用。本专利技术的目的是从水稻中克隆受稻瘟病菌诱导的启动子P71Z4，并利用转基因技术进行功能验证，同时分析该基因在水稻中的组织表达模式，为利用抗性基因改良水稻病害抗性提供了技术资源。技术方案本专利技术涉及一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4，其特征在于：该启动子来自于粳稻品种日本晴基因组中CYP71Z4基因(NCBI登录号：Os10g0439800)转录调控区，是一段位于转录起始位点上游1948bp的DNA，序列如SEQIDNO.1显示。该基因启动子P71Z4克隆引物如下：上游引物是GgaattcTGGAGTCAGGATGCTTTTG,加EcoRI酶切位点；下游引物是GAagatctGACACAATATGGGAGGAGC，加BglII酶切位点，扩增CYP71Z4编码区5’端上游1948bpDNA序列片段。所述受病原诱导的水稻启动子P71Z4的应用，是指水稻启动子P71Z4通过响应稻瘟病菌侵染，从而调控目标基因表达在植物抗性育种中的应用。是指在利用转基因技术增强植物病害抗性时，水稻启动子P71Z4降低过度的抗病反应对植物自身的伤害。有益效果本研究所提供的水稻病原诱导启动子P71Z4的克隆及其应用，具有如下优点：通过本专利技术获得了水稻病原诱导型启动子P71Z4。将克隆的启动子P71Z4与目标抗病基因共同转入水稻，可以使转基因水稻受稻瘟病菌侵染后合理诱导目标抗病基因表达。从而避免转基因水稻因始终过量表达目标基因对自身造成的损伤，这也弥补了传统组成型启动子因始终强启动目标基因表达造成生长发育受阻等一系列致命缺陷。采用PCR(Polymerasechainreaction)技术可以从基因组中扩增得到本专利技术的启动子P71Z4以及任何一段DNA或与其同源的一段DNA。将克隆到的DNA片段构建携带有报告基因gus的遗传转化载体，利用农杆菌介导的遗传转化法，获得由启动子P71Z4驱动gus基因表达的转基因水稻。利用实验室人工接种方法对该转基因水稻进行稻瘟病接种，通过组织化学染色法和GUS活性检测从而鉴定启动子P71Z4响应病原侵染的能力。本专利技术利用启动子分析软件预测受病原诱导的启动子P71Z4，并利用PCR技术从粳稻模式种日本晴中克隆该启动子(图1)。成功构建了病原菌诱导型启动子P71Z4/gus融合的表达载体(图1)，通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法获得P71Z4/gus转基因水稻。并且证明启动子P71Z4受稻瘟病菌诱导(图2)。在P71Z4/gus转基因水稻中，主要在根、茎、叶片和谷粒中检测到GUS活性(图3)。P71Z4/gus转基因水稻受到稻瘟病菌侵染后，GUS蛋白活性显著升高，达到2倍以上(图4)，进一步说明P71Z4响应稻瘟病菌侵染。这些结果表明，该启动子P71Z4能够响应稻瘟病菌的侵染。附图说明图1P71Z4启动子克隆与载体构建。(A)启动子P71Z4序列PCR扩增电泳。1，2是用HS高保真酶PCR扩增启动子序列；M是DNAMarkerλDNA-HindIII。(B)启动子P71Z4/GUS融合表达载体构建。1，2是双酶切验证双元表达载体；M是DNAMarkerλDNA-HindIII。(C)启动子P71Z4/GUS融合表达载体构建图谱。hph编码潮霉素磷酸转移酶，是潮霉素抗性标记基因；35SP是花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子；P71Z4是预测的CYP71Z4基因启动子序列；gus是编码β-葡萄糖醛酸酐酶基因；RB和LB分别是T-DNA右边界和左边界。图2启动子P71Z4响应稻瘟病菌侵染。S，感稻瘟病水稻R109(邵敏等,转hrf1基因水稻对稻瘟病多小种非专化的稳定抗性.中国水稻科学,2008,22(5):459-464.)；R，抗稻瘟病转hrf1水稻NJH12(邵敏等,转hrf1基因水稻对稻瘟病多小种非专化的稳定抗性.中国水稻科学,2008,22(5):459-464.)；0、1、3、6和12分别代表水稻接种0、1、3、6和12小时。图3CYP71Z4基因表达模式。(A)叶片；(B)幼苗；(C)和(D)为茎节的横切面；(E)谷粒；(F)根。图4转P71Z4启本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4，其特征在于：该启动子来自于粳稻品种日本晴基因组中CYP71Z4基因转录调控区，是一段位于转录起始位点上游1948bp的DNA，序列如SEQIDNO.1显示。

【技术特征摘要】
1.一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4，其特征在于：该启动子来自于粳稻品种日本晴基因组中CYP71Z4基因转录调控区，是一段位于转录起始位点上游1948bp的DNA，序列如SEQIDNO.1显示。2.根据权利要求1所述一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4，其特征在于：该基因启动子P71Z4克隆引物如下：上游引物是GgaattcTGGAGTCAGGATGCTTTTG，加EcoRI酶切位点；下游引物是GAagatctGACACAATAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文奇，杨杰，王芳权，王军，范方军，朱金燕，仲维功，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32