一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用。本发明专利技术提供的技术方案利用双荧光素酶报告基因系统，可实现半自动化、可对候选化合物进行大规模的高通量筛选。本发明专利技术还特别提供了MC2和/或MC3在调节LvGST活性、调控NRF2‑Keap1通路或制备防治氧化应激引起的疾病的药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用
本专利技术涉及分子生物学、靶向药物筛选领域，具体涉及一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用。
技术介绍
机体内时刻发生着物质、能量代谢，同时伴随着各种氧化反应，于细胞中产生众多自由基分子。其中活性氧分子(reactiveoxygenspecies,ROS)是最重要也是研究最为透彻的一类，因此它也通常被作为氧化应激的特征分子。ROS有2种来源：一种是内源性，线粒体呼吸链氧化磷酸化过程活性氧泄漏及过氧化物酶体和被激活的炎性细胞所产生等；另一种是外源性，例如外源化合物、病原体、促炎细胞因子和重金属诱导所产生等。当细胞受到内外环境的刺激后，ROS等产生增多，可能会打破机体氧化-抗氧化系统间的平衡，并最终导致氧化应激。氧化应激状态下ROS等自由基分子对生物大分子的破坏作用是其造成细胞损伤的主要原因。其中，蛋白质和DNA是ROS攻击的主要靶标。ROS的攻击会造成蛋白质结构突变或生物活性丧失、DNA链断裂、DNA位点突变、DNA双链畸变及原癌基因、肿瘤抑制基因突变，最终导致机体产生氧化损伤。而另一方面，一定含量的ROS不仅不会对机体造成损伤，更有杀灭病原体及解毒等作用。这对于缺乏获得性免疫的无脊椎动物显得尤为重要。ROS在一些重要的免疫反应，如“呼吸爆发”(respiratoryburst,RB)及包裹作用(encapsulation)中均发挥关键了作用。前者通过细胞大量摄入氧气，激活体内的氧化酶，使体内产生高浓度的超氧阴离子并生成多种活性氧中间体，进而利用它们杀灭细菌；后者则是血细胞结合大的入侵物，如寄生生物、原生生物及线虫等，并在入侵物周围形成多层的囊腔，随后囊腔内入侵物被腔内的ROS和活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)等毒杀或窒息而死。因此，机体氧化-抗氧化的系统之间平衡对于真核生物正常生理活动乃至生存至关重要。由于ROS对细胞正负两方面的不同效应与其浓度密切相关，因此机体氧化-抗氧化系统需要精确调控以保持平衡。氧化应激打破细胞内氧化还原状态的平衡，从而激活或抑制许多信号通路和一些信号转导分子，如NRF2-Keap1通路、NF-κB通路、MAPKs、激酶蛋白、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)和蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)等，最终调节效应因子基因的表达。Nrf2是氧化应激响应核心通路Nrf2-Keap1的转录因子，存在于生物体各类细胞中。它的缺失或激活障碍直接引起细胞对应激源的敏感性变化。该通路另一重要蛋白Keap1通过与Nrf2中富含半胱氨酸的区域结合而使后者绝大部分无法进入细胞核，从而基本抑制Nrf2的转录因子活性，避免引起细胞对应激源的敏感性升高。当细胞发生氧化应激或胞内ROS浓度过高时，Keap1中的半胱氨酸发生酸磷酸化，随后Keap1作为E3连接酶的活性变弱，Nrf2和Keap1分离，导致Nrf2泛素化和降解减少，细胞质中自由的Nrf2增多，随之转移进细胞核的Nrf2亦增多。进入细胞核的Nrf2与Maf蛋白形成异源二聚体，并结合到靶基因启动子区的抗氧化反应元件(antioxidantresponsiveelement,ARE)。随后，含有Nrf2-Maf二聚体的转录起始复合物激活并启动细胞中众多的抗氧化应激效应基因，如谷胱甘肽还原酶家族基因(glutathionereductasefamilygene)基因、氧硫还蛋白系统(thioredoxinsystemgene)及过氧化物酶家族基因(peroxidasefamilygene)等效应因子基因的转录，进而维持细胞内氧化-抗氧化体系的平衡[12]。事实上，生理条件下Nrf2-Keap1通路能维持低强度的活性，以将代谢过程产生的ROS稳定控制在一定水平。Nrf2-Keap1通路不仅直接参与抗氧化基因的调控，而且还可通过协调指挥其他抗氧化应激相关通路，如PI3K-Akt通路及TLR通路等，共同维持细胞内部氧化-抗氧化系统的平衡。另外，RNS[包括一氧化氮(NO)、过氧化亚硝酰阴离子(ONOO-)、亚硝酰氢(HNO)、亚硝酸根离子(NO2-)和二氧化氮(NO2)]及外源物引起的内质网应激[(endoplasmicreticulumstress,ER)-stress]亦可激活Nrf2-Keap1通路。可见，Nrf2-Keap1通路是细胞内维持氧化-抗氧化系统平衡的核心信号通路。可见，Nrf2-Keap1通路调控化合物无论在理论研究或运用实践方面都有重要作用。Nrf2-Keap1通路调控化合物的筛选涉及到该通路的活性检测。该通路活性最直接的检测方法是检测Nrf2的入核情况，这通常需采用Western-blot技术或免疫荧光技术。然而如果采用上述两种技术均无法进行大规模的筛选。另一技术路线则是检测Nrf2-Keap1通路下游基因的表达情况，则可以采用报告基因技术实现高通量的筛选目前，还未有关于基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选方法的报道。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用。本专利技术第一方面提供了一种用于筛选抗氧化化合物的序列，可被Nrf2蛋白特异性识别，所述序列包括：1)SEQIDNO.4所示核苷酸序列；2)与SEQIDNO.4所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。具体地，SEQIDNO.4的序列为TGCAAAGTCAC。本专利技术实施例中，“互补”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克碱基配对或其他非传统类型形成一个或多个氢键。本专利技术实施例中，“互补”具有不同的互补百分比，包括“完全互补”或“基本上互补”。“互补百分比”表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度。本专利技术一优选实施例中，所述序列包括：1)SEQIDNO.3所示核苷酸序列；2)与SEQIDNO.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本专利技术一实施例中，所述Nrf2蛋白的氨基酸编码序列为SEQIDNO.8所示，或与其同源性不低于50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或99.9％的同源序列。本专利技术第二方面提供了一种载体，所述载体包括第一方面所述的序列；本专利技术一实施例中，所述载体为质粒载体。本专利技术一优选实施例中，第一方面所述的序列插入所述质粒载体的多克隆位点。更优选的实施例中，所述载体为质粒载体pG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于筛选抗氧化化合物的序列，可被Nrf2蛋白特异性识别，其特征在于，所述序列包括：1)SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于筛选抗氧化化合物的序列，可被Nrf2蛋白特异性识别，其特征在于，所述序列包括：1)SEQIDNO.4所示核苷酸序列；2)与SEQIDNO.4所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的用于筛选抗氧化化合物的序列，其特征在于，所述Nrf2蛋白的氨基酸编码序列为SEQIDNO.8所示，或与其同源性不低于50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或99.9％的同源序列。3.如权利要求1所述的用于筛选抗氧化化合物的序列，其特征在于，序列包括：1)SEQIDNO.3所示核苷酸序列；2)与SEQIDNO.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。4.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1所述的序列。5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为质粒载体或病毒载体。6.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求1所述序列、权利要求4所述的载体中的一种或多种。7.一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈义烘，翁少萍，何建国，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44