一种增强丝蛋白生产制备的表达系统技术方案

本发明专利技术公开了一种增强丝蛋白生产制备的表达系统，所述表达系统含有蛋白的编码序列和突变型tRNA。所述蛋白可以是序列为SEQ ID NO:8的丝蛋白，所述突变型tRNA序列为SEQ ID NO:18所示。本发明专利技术表达的丝蛋白力学性质优异，本发明专利技术的表达系统有益于增强丝蛋白表达，有助于制造丝蛋白纤维材料。所述突变型tRNA能够显著上调宿主细胞中基因编码区含有多个稀有密码子的蛋白，特别是含有多个稀有密码子的丝蛋白的表达；其效果优于天然识别稀有密码子的tRNA。在此基础上，本发明专利技术还提供了利用本发明专利技术的突变型tRNA上调宿主细胞中蛋白表达的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种增强丝蛋白生产制备的表达系统
本专利技术涉及分子生物学领域。具体地说，本专利技术涉及一种突变型tRNA及其制备方法以及在上调蛋白表达中的应用。
技术介绍
在微生物代谢改造中，人们希望尽可能提高特定蛋白的表达。增强表达的一条途径是增加编码基因的拷贝数或者选择高强度启动子。然而如果目的基因编码区含有多个稀有密码子，由于缺乏某几种tRNA会直接导致翻译错误或中止(任增亮,堵国成,陈坚等.,大肠杆菌高效表达重组蛋白策略[J].中国生物工程杂志,2007,27(9):103-109)。目前，主要采用以下几种方法来降低这种不利影响：第一，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列下改造碱基序列，使密码子尽量满足宿主菌较高使用率的密码子。第二，可以选择表达低利用率的稀有密码子的宿主菌，如Rosetta(DE3)做宿主；第三,可以表达编码tRNA的基因，使外源蛋白得到高效表达。上述方法有各自的优缺点：第一种方法中，如果同时对多个基因或者染色体上的基因进行密码子优化，那么研究者需要大量工作对其进行代谢改造；第二种方法中，表达宿主受到限制；第三种方法中，在表达编码tRNA的基因后，如何进一步增强表达编码tRNA基因后的蛋白表达，尚不清楚。因此，本领域急需能够识别稀有密码子，并且能够在宿主细胞中切实上调蛋白表达的tRNA。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够识别稀有密码子，并且能够在宿主细胞中切实上调蛋白表达的tRNA以及包含所述tRNA的表达系统和宿主细胞。本专利技术的目的还在于提供利用本专利技术的突变型tRNA上调宿主细胞中蛋白表达的方法。在第一方面，本专利技术提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸为选自下组的序列：a)如SEQIDNO：18所示的核苷酸序列；b)将SEQIDNO：18所示的核苷酸序列，在反密码子区外经过取代、插入或缺失1-10个碱基，优选的1-5个碱基，更优选的1-3个碱基形成的、并基本具有a)所述核苷酸序列的功能的多核苷酸序列；c)与a)-b)任意所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。在优选的实施方式中，所述分离的多核苷酸是突变型tRNA。在优选的实施方式中，所述分离的多核苷酸衍生自埃希氏菌属细菌；优选地，衍生自大肠杆菌。在第二方面，本专利技术提供一种表达系统，其包含本专利技术第一方面所述的多核苷酸和编码待表达的蛋白的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述编码待表达的蛋白的核苷酸序列中含有两个以上的稀有密码子GGA。在具体的实施方式中，所述编码待表达的蛋白的核苷酸序列为选自下组的序列：a)如SEQIDNO：8或SEQIDNO：16所示的核苷酸序列；b)将SEQIDNO：8或SEQIDNO：16所示的核苷酸序列，经过取代、插入或缺失1-10个碱基，优选的1-5个碱基，更优选的1-3个碱基形成的、并基本具有a)所述核苷酸序列的功能的多核苷酸序列；c)与a)-b)任意所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。在第三方面，本专利技术提供一种宿主细胞，其包含本专利技术第一方面所述的多核苷酸或第二方面所述的表达系统。在具体的实施方式中，所述的宿主细胞属于埃希氏菌属(Escherichia)。在具体的实施方式中，所述的宿主细胞属于大肠杆菌(Escherichiacoli)。在第四方面，本专利技术提供本专利技术第一方面所述的多核苷酸或本专利技术第二方面所述的表达系统在上调宿主细胞中蛋白表达的用途。在第五方面，本专利技术提供一种上调宿主细胞中蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：1)培养本专利技术第三方面所述的宿主细胞；和2)从1)的培养体系中获得表达上调的蛋白。在优选的实施方式中，所述宿主细胞是埃希氏菌属细菌；优选地，是大肠杆菌。在优选的实施方式中，所述蛋白可以是宿主细胞的内源性蛋白或外源性蛋白。在优选的实施方式中，所述蛋白的编码序列中包含两个以上的稀有密码子GGA。在优选的实施方式中，所述蛋白是氨基酸序列为SEQIDNO：8或SEQIDNO：16的蛋白。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了表达glyT和本专利技术的glyVm对荧光值的影响；其中，1：E1的单位菌浓荧光值；2：E2单位菌浓荧光值；和3：E3单位菌浓荧光值。图2显示了表达glyT和本专利技术的glyVm对荧光值的影响；其中，1：E4的单位菌浓荧光值；2：E5单位菌浓荧光值；和3：E6单位菌浓荧光值。图3显示了SDS-PAGE验证glyT和glyVm回补对蛋白表达的影响；其中，1：Marker；2：E4全菌蛋白；3：E5全菌蛋白；4：E6全菌蛋白。具体实施方式专利技术人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将识别常用密码子的tRNA的反密码子区域进行改造，使得改造后的突变型tRNA能够识别稀有密码子，这种突变型tRNA能够有效上调宿主细胞中蛋白的表达；专利技术人进一步发现，这种突变型tRNA上调宿主细胞中蛋白表达的效果甚至远比能识别稀有密码子的天然tRNA更好。在此基础上完成了本专利技术。tRNA(转运RNA)本文所用的术语“转运RNA(TransferRibonucleicAcid，tRNA)”具有本领域技术人员常规理解的意义，其是指是具有携带并转运氨基酸功能的小分子核糖核酸。tRNA主要是携带氨基酸，在mRNA指导下合成蛋白质；即，以mRNA为模板，将其中具有密码意义的核苷酸顺序翻译成蛋白质中的氨基酸顺序。tRNA与mRNA是通过反密码子与密码子相互作用而发生关系的，即，tRNA靠反密码子与mRNA识别。一种tRNA只能携带一种氨基酸，但一种氨基酸可被不止一种tRNA携带。在生物体内，DNA分子上的tRNA基因经过转录生成tRNA前体，然后被加工成成熟的tRNA。密码子本文所用的术语“密码子”具有本领域技术人员常规理解的意义，其是指信使RNA分子中每相邻的三个核苷酸编成一组，在蛋白质合成时，代表某一种氨基酸的规律。信使RNA在细胞中能决定蛋白质分子中的氨基酸种类和排列次序。信使RNA分子上的三个碱基决定一个氨基酸。遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimalcodons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rareorlow-usagecodons)。本专利技术的突变型tRNA在大肠杆菌中，识别甘氨酸的稀有密码子GGA的tRNA的编码基因是glyT。本专利技术人发现通过改造glyV中反密码子区碱基，将glyV的GCC(glyV序列为SEQIDNO:1，GCC碱基为其的34-36位碱基)突变为TCC，得到glyV突变体，简称glyVm。这种突变体能够上调宿主细胞中蛋白的表达，其效果甚至优于天然识别甘氨酸的稀有密码子GGA的基因glyT。因此，为克服因宿主细胞缺乏针对目的基因编码区中所含稀有密码子的tRNA导致翻译错误或中止的缺陷，本专利技术提供了这样一种突变型tRNA，其反密码子区域碱基为TCC。本专利技术的突变型tRNA衍生自埃希氏菌属细菌；优选地，本专利技术的突变型tRNA衍生自大肠杆菌。在具体的实施方式中，本专利技术的突变型tRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:18所示。在本专利技术的具体的突变型tRNA的基础上，本领域技术人员不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为选自下组的序列：a)如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；b)将SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，在反密码子区外经过取代、插入或缺失1‑10个碱基，优选的1‑5个碱基，更优选的1‑3个碱基形成的、并基本具有a)所述核苷酸序列的功能的多核苷酸序列；c)与a)‑b)任意所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为选自下组的序列：a)如SEQIDNO：18所示的核苷酸序列；b)将SEQIDNO：18所示的核苷酸序列，在反密码子区外经过取代、插入或缺失1-10个碱基，优选的1-5个碱基，更优选的1-3个碱基形成的、并基本具有a)所述核苷酸序列的功能的多核苷酸序列；c)与a)-b)任意所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。2.一种表达系统，其包含权利要求1中所述的多核苷酸和编码待表达的蛋白的核苷酸序列。3.权利要求2中的所述表达系统，其特征在于，所述编码待表达的蛋白的核苷酸序列中含有两个以上的稀有密码子GGA。4.权利要求2中所述的表达系统，其特征在于，所述编码待表达的蛋白的核苷酸序列为选自下组的序列：a)如SEQIDNO：8或SEQIDNO：16所示的核苷酸序列；b)将SEQIDNO：8或SEQIDNO：16所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：訾祯祯，柏文琴，张婷，白玉，陶勇，吕建仁，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12